NCI-H1944人非小细胞肺癌贴壁细胞系的应用研究！
小杨 / 2024-03-14 08:56:34
一、背景
1）配制完全培养基：基础培养基+胎牛血清+双抗（特殊培养基特殊配置）；
2）细胞复苏：取5ml完全培养基于15ml离心管中，37℃水浴锅预热，从液氮管（或者-80度冰箱）中快速取出冻存的细胞，放入37℃水浴锅中，摇晃使快速化冻（1min左右），然后将化冻的细胞和预热的培养基，移入超净工作台中，化冻的细胞加入到含预热培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5min；
3）吸弃上清，得到细胞沉淀，用2ml完全培养基轻轻重悬细胞，加入到T25培养瓶中，做好标记，放入37℃，5%CO2饱和适度培养箱中培养（培养皿复苏效果更好）；
4）24h后，观察细胞贴壁情况（未贴壁的即为死细胞--针对贴壁细胞），吸弃旧培养基，加入新鲜的预热（室温或37℃）的完全培养基，继续培养。
1）待细胞生长到80%-90%汇合度时，吸弃旧的培养基，加入1ml无菌PBS润洗一次，以去除残余的培养基及血清（血清含有胰酶的抑制因子），然后加入1ml 0.25%胰酶，37℃培养箱中消化（1~2min左右，不同细胞消化时间不同），取出细胞，镜下观察细胞至细胞皱缩变圆；
2）加入1ml完全培养基（含FBS）终止消化，轻轻拍打，使细胞脱落下来成单个细胞悬液，收集细胞于15ml无菌离心管中，1000rpm，离心5min；
3）收集细胞沉淀，完全培养基重悬，一分为二（可根据细胞生长速度调整比例），分别加入到2个新的培养瓶中，做好标记，放入培养箱中培养。
1）按照细胞传代方法，在超净工作台内消化收集细胞沉淀，取少量细胞用于计数；
2）用预冷的1ml冻存液（90%完全培养基+10%DMSO）或者无血清细胞冻存液重悬细胞，加入到1.2ml冻存管中，密度为1*106个/ml。
3）放入程序冻存盒，-80℃过夜后，转入液氮长期保存。
三、应用
在非小细胞肺癌(NSCLC)中,哺乳动物雷帕霉素靶标(m TOR)异常激活促进了肿瘤的发生发展。PQR620是一种新型高效的m TOR激酶抑制剂。
在这里测试了它在NSCLC细胞中的潜在活性。在原代人类NSCLC细胞和已建立的细胞系(A549和NCI-H1944)中,PQR620抑制细胞生长、增殖和细胞周期进程,以及细胞迁移和侵袭,同时显著诱导细胞凋亡。PQR620破坏了m TOR复合物1(m TOR-Raptor)和m TOR复合物2(m TOR-Rictor-Sin1)的组装,并阻断了NSCLC细胞中的Akt、S6K1和S6磷酸化。过表达持续性激活的Akt1(S473D)激活Akt-m TOR信号通路仅部分抑制PQR620诱导的NSCLC细胞的细胞毒性。
PQR620在Akt1/2沉默的NSCLC细胞中仍然具有细胞毒性,这表明PQR620并不完全依赖Akt-m TOR信号发挥抑制NSCLC进展的功能。
事实上,PQR620在原发性NSCLC细胞中诱导鞘氨醇激酶1(Sph K1)抑制、神经酰胺产生和氧化应激。体内研究表明,每天口服单剂PQR620可有效抑制严重联合免疫缺陷小鼠的原发性NSCLC异种移植物生长。在PQR620处理的裸鼠移植瘤中,检测到Akt-m TOR失活、凋亡诱导、Sph K1抑制和氧化应激。
总之,PQR620通过m TOR依赖性和非依赖性机制发挥有效的抗NSCLC细胞活性。
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