EL4（小鼠淋巴瘤细胞）的培养操作及应用！
小杨 / 2024-03-13 08:49:44
一、背景
EL4是一种来源于小鼠的淋巴瘤细胞系，常被用作生物医学研究的模型系统。这种细胞系具有特定的生物学特性和广泛的应用价值，尤其在免疫学、肿瘤学和药物筛选等领域中备受关注。
EL4细胞系具有快速增殖和易于培养的特点，这使得它成为研究淋巴细胞生物学行为的理想模型。此外，EL4细胞系还具有一些特定的基因表达模式和信号转导通路，这使得它成为研究肿瘤发生和发展机制的重要工具。
在免疫学研究中，
EL4细胞系常被用作T细胞淋巴瘤的模型，用于研究T细胞的增殖、分化和凋亡等生物学过程。同时，EL4细胞系也可用于研究肿瘤免疫逃逸机制，以及免疫疗法对肿瘤细胞的杀伤作用。
在药物筛选方面，
EL4细胞系具有对多种化疗药物的敏感性，因此常被用作药物筛选的模型。通过研究药物对EL4细胞系的杀伤作用，可以评估药物的抗肿瘤活性，为临床用药提供参考。
1)复苏EL4细胞系：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)EL4细胞系传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)EL4细胞系冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。
下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
三、应用
EL4可以用于S1P信号通路影响肥胖合并淋巴瘤侵袭性生长机制研究：
为肥胖合并淋巴瘤患者这一特殊患者群体,通过改善脂代谢提高预后提供理论依据。
方法：
1、在人标本实验中:对人NHL微组织阵列样本进行S1P水平免疫组化染色;对于常见亚型非霍奇金淋巴瘤,使用GEO数据库研究用于S1P生物合成的两种鞘氨醇激酶(SPHK1和SPHK2)的基因表达。进一步证实非霍奇金淋巴瘤存在鞘脂代谢异常。
2、构建肥胖小鼠模型:出生6周C57BL/6J小鼠,西方高脂肪饮食(western style high fat diet,WSHFD,35%w/w脂肪和26%w/w果糖通)及其对照饮食喂养16周,构建肥胖脂代谢异常小鼠模型。(1)对小鼠进行体重、脂肪重量测定、用ELISA测定血清甘油三酯水平,验证脂质代谢异常小鼠模型建模成功;(2)应用western blot对小鼠脂肪组织进行脂肪酸分解酶p HSL、HSL检测;应用免疫组化对脂肪组织中IRS,MPO进行检测;探讨肥胖对脂代谢异常及炎症反应两方面影响；
3、在脂代谢异常小鼠背景下,皮下种植小鼠EL4细胞(T细胞淋巴瘤),建立淋巴瘤模型。分为EL4-CD、EL4-WSHFD两组,监测21天内小鼠体重、肿瘤大小变;21天后处死小鼠,评估肿瘤重量,依据病理仿照临床Ann-Arbor分期评估累及范围;通过western blot检测两组c-MYC,CCND1,E-cadherin,Vimentin;ELISA测定两组血清及淋巴瘤组织甘油三酯水平;探讨脂代谢异常对淋巴瘤增殖及EMT的影响。
4、EL4-CD、EL4-WSHFD两组小鼠通过RT-PCR检测脂质代谢通路及S1P通路代谢酶,通过western blot,免疫组化检测两组p SPHK1/SPHK1,S1PR1,S1PR3蛋白质表达水平;探讨脂代谢异常对淋巴瘤FA的外源性摄取及内源性合成的影响及对S1P通路影响。
5、应用细胞实验探索S1P对淋巴瘤增殖及EMT的机制:测定人HH、SUDHL-4淋巴瘤细胞系S1PR表达,空白对照、S1P、S1PR抑制剂处理人HH、SU-DHL-4淋巴瘤细胞系,通过XTT方法测定增殖,transwell评估细胞迁移,western blot测定S1P-S1PR下游YAP信号转导通路。
6、探索S1P对肿瘤微环境巨噬细胞的影响:动物实验:构建脂代谢异常EL4淋巴瘤小鼠模型腹水淋巴瘤瘤模型;通过免疫荧光及流式细胞学检测淋巴瘤微环境中骨髓衍生抑制细胞(MDSCs)CD11b+Ly6Chi及肿瘤相关巨噬细胞F4/80+CD206+表达;CD4+、CD8+T细胞比例；
7、通过细胞实验探索S1P诱导巨噬细胞极化机制:探索巨噬细胞ALOX15表达实验:通过免疫组化探索脂代谢异常EL4小鼠淋巴瘤ALOX15表达;并用人单核细胞THP定向刺激分化成M1、M2,S1P验证ALOX15在M1、M2中表达情况;WT小鼠及Alox15-/-小鼠经CD和WSHFD喂养后,构建小鼠腹腔淋巴瘤模型,流式细胞术检测腹腔积液CD11b+Ly6Chi及肿瘤相关巨噬细胞F4/80+CD206+表达;8.构建脂代谢异常EL4淋巴瘤小鼠模型,给予白藜芦醇和PDL1抑制剂治疗,探索白藜芦醇通过改善S1P代谢,对淋巴瘤增殖的抑制作用及对PDL1的协同作用。
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