NCI-H2227人小细胞肺癌贴壁细胞系的应用！

一、背景

NCI-H2227人小细胞肺癌贴壁细胞系是1989年8月从一名54岁白人男性小细胞肺癌皮肤转移灶中分离得到的细胞系。

二、NCI-H2227人小细胞肺癌贴壁细胞系培养条件

1、NCI-H2227人小细胞肺癌贴壁细胞系培养基：RPMI-1640培养基（不含Hepes）+10%胎牛血清+1%双抗+800ng/ml Taxol

2、温度：37.0°C

3、气体:空气95%，CO2 5%

三、NCI-H2227人小细胞肺癌贴壁细胞系复苏操作要点

1）将培养基在37℃水浴锅预热；准备一个15mL无菌的离心管，加入8mL预热培养基。

2）将冻存NCI-H2227人小细胞肺癌贴壁细胞系细胞从液氮罐中取出，快速放入37℃水浴锅中复温（可准备一洁净的烧杯，装满37℃的水，细胞冻存管取出后迅速放入烧杯内，再逐步转移到水浴锅中）。轻轻晃动冻存管，使细胞能在1~2min内完全解冻，使细胞能尽快通过最易受损的温度段（-5~0℃）。注意冻存管管口不能没入水中，BRL(大鼠肝细胞)避免引起污染。

3）用75%酒精擦拭冻存管后再置于超净台内，将管内细胞转移至准备好的离心管内，轻轻吹打液体，使细胞均匀分散，降低DMSO浓度，吹打时避免产生气泡。用新鲜培养基洗管壁2次，均转移至离心管内。

4）800rpm离心5min，弃上清，加入新鲜的培养基，吹打制成细胞悬液。

5）将NCI-H2227人小细胞肺癌贴壁细胞系细胞悬液转移至T25细胞瓶内，补加适量的培养基，轻轻晃动细胞瓶使细胞分布均匀，放入温箱内培养。

6）第二天观察细胞贴壁生长情况，换新鲜培养基以去除死细胞。继续培养，待细胞长至80~90%汇合时正常传代。一般刚复苏的细胞需经过2~3次传代，细胞活力恢复后才能进行后续的实验。

四、应用

NCI-H2227人小细胞肺癌贴壁细胞系可用于小细胞肺癌细胞悬浮和贴壁生长异质性与化疗耐药相关性的研究：

NCI-H2227人小细胞肺癌贴壁细胞系可以用于小细胞肺癌(Small cell lung cancer,SCLC)是一种高级别的神经内分泌肿瘤,具有进展快及早期转移等特征。SCLC早期对化疗敏感,但往往会形成耐药复发。值得注意的是,血液系统恶性肿瘤往往对化疗敏感,而实体瘤则更为耐药,两者最明显的区别在于细胞形态学的不同。血液系统肿瘤细胞呈悬浮生长,实体瘤细胞大多为贴壁生长,这提示肿瘤细胞的形态学差异与化疗耐药之间存在关联。

此外,SCLC来源的细胞系其生长模式具有明显的异质性,但其形成及与化疗耐药的联系仍不清楚。

研究方法：通过生物信息学进行pan-cancer分析,对肿瘤细胞系悬浮、贴壁生长状态,以及不同生长状态所涉及的分子机制进行分析。然后对所有肺癌细胞进行pan-lung cancer分析,比较SCLC与非小细胞肺癌(NSCLC)之间以及不同形态的SCLC细胞之间的差异表达基因及涉及的信号通路。再对肿瘤细胞系的生长模式与化疗耐药进行相关性分析,找出与细胞形态之间最具相关性的基因或通路。

然后使用基因改造小鼠模型进一步验证。利用小分子高通量筛选技术发现克服SCLC化疗耐药的相应通路的候选抑制剂,并且使用SCLC移植瘤模型从体内进一步验证体外实验结果。

研究结果：生信分析结果显示,贴壁生长的肿瘤细胞中PI3K/AKT/m TOR信号通路激活,而且粘附生长的细胞较悬浮细胞对化疗更不敏感。此外,对SCLC细胞内部之间的分析显示,SCLC具有明显的形态学差异,其贴壁细胞中PI3K/AKT/m TOR信号通路也处于激活状态而且与其耐药相关。在过表达EGFR激活PI3K/AKT/m TOR通路后,悬浮生长的SCLC细胞出现向贴壁转化的趋势,且对化疗药物的处理相对不敏感。

使用PI3K/AKT/m TOR通路的小分子抑制剂库在SCLC细胞中进行筛选,贴壁且耐药的细胞表现出更高的敏感性,而且PI3K/AKT/m TOR通路抑制剂GSK2126458联合化疗药物在细胞及体内均发挥协同抗瘤的作用。

结论：贴壁或半贴壁生长的肿瘤细胞相较于悬浮细胞系PI3K/AKT/m TOR通路激活,并且对化疗药物更为耐受。PI3K/AKT/m TOR通路激活可促进悬浮SCLC细胞系向贴壁转化且增加其化疗耐药性。此外,PI3K/AKT/m TOR通路抑制可克服贴壁生长SCLC细胞的耐药,并且与EP具有协同作用。

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