微生物基因组改造的背景与应用及相关研究！

一、背景

微生物基因组改造是通过打断、缺失或替换基因组上目的基因，达到研究和利用基因功能和性状的目的，已成功地在以下种类的微生物中实现了基因改造：大肠杆菌（实验室菌株和野生菌株）、沙门氏菌、奇异变形杆菌、阪崎肠杆菌、阴沟肠杆菌、葡萄球菌、链球菌、乳酸菌、假单胞菌等。微生物基因组改造用于细菌（大肠杆菌）的基因敲入、敲出和替换。针对大肠杆菌，金斯瑞开发出新型的λRed-CRISPR/Cas技术，结合传统λRed重组和CRISPR/Cas9方法以实现无痕的靶基因编辑。细菌基因敲除的传统方法是利用自身的Rec系统对外源进入的DNA进行同源重组，从而实现目标基因的等位替换。

通过设计靶基因的同源融合片段，将其克隆至自杀载体中，自杀载体通过接合输入到靶细菌。通过抗生素筛选细菌基因组靶位点整合有自杀载体的插入突变株。在第二轮反向选择压力下，只有细菌基因组发生第二次同源重组并丢失自杀质粒的细菌才可以存活。最后通过PCR鉴定即可获得目的基因的缺失突变株。

自然界中的微生物总是通过各种各样的保护机制，使它们能够与恶劣的环境及侵袭性核酸共存。许多微生物都能通过基于基因序列特异性的方式抵抗核酸入侵。CRISPR/Cas9即是属于这种保护机制之一。在此背景下，推出CRISPR方法进行微生物的基因组改造服务（包括基因敲除、定点突变、定点插入外源序列等）。相比于传统的基因敲除方法，该方法速度快，无痕；非常便于后续的实验研究。

CRISPR是家族DNA的内发现的序列的基因组的原核生物，如细菌和古细菌。这些序列来源于先前已感染原核生物的病毒的DNA片段，用于在随后的感染过程中检测和破坏类似病毒的DNA。因此，这些序列在原核生物的抗病毒防御系统中起关键作用。Cas9是一种酶，它使用CRISPR序列作为指导来识别和切割对于所述CRISPR序列互补的DNA的特定链。Cas9酶与CRISPR序列一起形成称为CRISPR-Cas9的技术的基础，其可用于编辑生物体内的基因。

二、应用

微生物基因组改造可用于发掘外源蛋白表达过程中相关的靶点基因研究：

在谷氨酸棒状杆菌CRISPR/Cas9基因编辑系统的开发及外源蛋白高效表达宿主改造的实验中利用CRISPR/Cas9技术,在C.glutamicum中构建了一套高效的基因编辑工具。同时以C.glutamicum CGMCC1.15647为出发菌株,通过分析不同溶氧状态下细胞转录组数据发掘外源蛋白表达过程中相关的靶点基因。在此基础上,利用CRISPR/Cas9基因编辑系统对发掘的优化靶点(mepA,porB和clpC)进行宿主细胞改造,改造后的宿主细胞具有外源蛋白表达能力提高的特点,并成功的利用该优化后的宿主实现了N端脑钠肽前体(N-terminal pro-brain natriuretic peptide,NT-proBNP)在C.glutamicum中的表达。

最后还研究了mepA和porB影响外源蛋白表达的机理。研究中分别构建三个基因的单敲除及共敲除菌株,并利用GFP和scFv作为模式蛋白来检测外源蛋白能力的变化,结果表明在mepA,porB和clpC三基因敲除菌种中GFP和scFv表达量相比于野生型菌株都有提高的现象。上述研究结果为优化宿主细胞提供了新的方法,并成功得到一株能够更好表达外源蛋白的C.glutamicum宿主。(C.glutamicum中NT-proBNP蛋白最佳表达模式组合的确立及表达。

通过GFP作为模式蛋白在C.glutamicum中构建了一套可以快速探究外源蛋白组成型胞内表达,诱导型胞内表达,组成型分泌表达,诱导型分泌四种表达模式组合的方法。利用该系统探究了NT-proBNP蛋白的最佳表达模式组合,结果表明NTproBNP在C.glutamicum的最佳表达模式为组成型胞内表达,同时利用mepA,porB和clpC三基因敲除菌株ΔclpCΔporBΔmepA作为表达宿主实现了NT-proBNP在C.glutamicum中的高效表达,产量达到118.8 mg/g DCW。上述探究外源蛋白最适表达模式的方法及NT-proBNP蛋白的成功表达的实例为对应用C.glutamicum作为外源蛋白表达宿主具有借鉴意义。

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