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H-4-II-E[H4-II-E](大鼠肝细胞瘤)的应用!
小杨 / 2022-01-15


一、背景

H-4-II-E[H4-II-E](大鼠肝细胞瘤)分离自大鼠肝细胞瘤,H-4-Ⅱ-E细胞可诱导产生芳香烃羟化酶,用于检测环境样品或食物提取物种皮克级的多氯联苯有机化合物。生长培养基MEM+10%FBS+1%P/S,培养气相条件:空气,95%;CO2,5%,温度:37℃。

二、培养步骤

1)复苏细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻,加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟,弃去上清液,补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入6cm皿中),培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2)细胞传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。

3)细胞冻存:待细胞生长状态良好时,可进行细胞冻存。弃培养基后加入少量胰酶,细胞变圆脱落后,进行离心收集,1000RPM条件下离心8-10分钟,去除上清,按冻存数量加入到冻存液中。

对于贴壁细胞,传代可参考以下方法:

1.弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1-2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中,置于37℃培养箱中消化1-2min,然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

3.轻轻吹打细胞,完全脱落后吸出,在1000RPM条件下离心8-10分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养液后吹匀。

4.按5-6ml/瓶补加培养液,将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

三、应用

用于miR-200a在抑制成体肝干细胞恶性表型和功能中的调控作用及其机制研究:

明确miR-200a在肝卵圆细胞系WB-F344及肝癌细胞系中的表达水平,进而研究miR-200a外源性功能抑制对WB-F344细胞表型及功能的影响,最后探讨miR-200a调控WB-F344细胞表型及功能的具体分子机制。

方法:

1、分别选择大鼠肝卵圆细胞系WB-F344,大鼠正常肝上皮细胞系BRL以及大鼠肝癌细胞系H-4-II-E,CBRH-7919,RH-35,利用qRT-PCR方法检测miR-200a在不同细胞中的表达水平,明确miR-200a在肝癌发生中的表达变化。

2、构建慢病毒载体介导的miR-200a功能稳定抑制细胞系WB-anti-miR-200a及对照细胞系WB-miR-NC,分别从miRNA水平、mRNA水平及蛋白水平进行转染效率及功能鉴定。

3、检测WB-anti-miR-200a细胞中HCSC相关表型及功能:具体包括生长增殖能力及自我更新能力(细胞计数实验、悬浮培养克隆球形成实验);凋亡水平变化(FITC-Annexin V-PI染色、Caspase3/7活性检测);HCSC标志物表达及肝系分化情况(qRT-PCR方法检测EpCAM、CD133、ABCG2、CK19、AFP、ALB等分子);细胞耐药能力(流式细胞术检测细胞与化疗药物共培养后凋亡水平);体内致瘤能力(裸鼠皮下成瘤检测)。

4、鉴定WB-anti-miR-200a细胞的EMT特征:光镜观察细胞形态变化;Transwell迁移实验检测细胞体外运动能力;western-blot方法检测E-cadherin、Vimentin、N-cadherin等EMT特征蛋白表达。

5、miR-200a靶基因的预测、验证:TargetScan软件预测并筛选β-连环蛋白(β-catenin)作为miR-200a的可能靶基因;双荧光素酶报告基因检测系统外源性验证miR-200a对β-catenin的调节作用;western-blot方法内源性验证WB-anti-miR-200a细胞中β-catenin的表达变化。

6、观察WB-anti-miR-200a细胞中Wnt/β-catenin通路的激活情况:细胞免疫荧光染色观察β-catenin的胞质及胞核表达情况;TopFlah/FopFlash报告基因实验检测β-catenin/T-细胞因子(T-cell factor,TCF)转录活性变化;western-blot方法检测Wnt/β-catenin通路下游分子c-Myc、cyclin D1的表达情况。

7、miR-200a通过调节β-catenin以及经典Wnt通路影响WB-F344细胞功能的鉴定:采用RNA干涉(RNAinterference,RNAi)技术瞬时下调WB-anti-miR-200a细胞中的β-catenin表达,观察细胞的自我更新能力(悬浮培养克隆球形成实验)及体外迁移能力(Transwell迁移实验)变化。

结果:

1、相对于WB-F344细胞及BRL细胞,miR-200a在3种肝癌细胞系H-4-II-E,CBRH-7919,RH-35中的表达水平均明显降低(P<0.01)。

2、慢病毒载体介导的WB-F344细胞中miR-200a功能抑制鉴定结果:WB-anti-miR-200a细胞中miR-200a表达明显下调(P<0.01),其已知靶基因ZEB2mRNA表达水平无明显变化,但蛋白表达明显增强。

3、WB-anti-miR-200a细胞出现HCSC相关表型和功能:生长增殖加快、悬浮培养克隆球形成能力增强,但凋亡水平未发生变化;高表达EpCAM、CD133、ABCG2、AFP、CK19等HCSC细胞标志物、低表达肝系分化成熟标志物ALB(P<0.05);对化疗药物杀伤的抗凋亡能力增强(P<0.05);具备裸鼠皮下移植强致瘤性。

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