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人胃粘膜上皮细胞的培养操作与应用!
小杨 / 2022-01-14


一、背景

GES-1人胃粘膜上皮细胞是人胃粘膜上皮成熟细胞系主要用于胃上皮细胞提供重要的模式系统。原代培养的胎儿正常胃粘膜上皮细胞用SV40病毒感染,3周左右分离出了转化细胞克隆,并建立了可在体外长期稳定传代的细胞系GES-1。

对此细胞的生物学特性分析表明:细胞的基因组中整合了SV40T基因,并在细胞核中表达。染色体为近三倍体(50~60之间)。除了转化特性之外,GES-1细胞基本保留了正常的细胞骨架结构(微丝、微管、角蛋白),粘蛋白反应阳性。接种在裸鼠中6个月观察无致瘤性。

二、细胞培养操作

1、培养基及培养冻存条件准备:

准备DMEM培养基(DMEM,GIBCO,),90%;胎牛血清,10%。培养条件:气相:空气,95%;二氧化碳,5%。温度:37℃,培养箱湿度为70%-80%。冻存液:90%血清,10%DMSO,现用现配。液氮储存。

2、细胞处理:

(1)复苏细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中(水面要低于冻存管盖部)摇晃解冻,移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

(2)细胞传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。

弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中,置于37℃培养箱中消化1-2分钟,然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加入3ml此细胞的培养基终止消化。

轻轻吹打后吸出,移入15ml离心管中,在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,加入1mL培养液后吹匀。移入到事先准备好的含有5ml培养基的T-25培养瓶中或含有14ml培养基的T-75培养瓶中培养。

(3)细胞冻存:待细胞生长状态良好时,可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时,先要消化处理并进行细胞计数。消化方法按照细胞传代方法的1-3步骤进行,最后的重悬液使用血清。悬浮细胞直接计数后离心,用血清重悬浮,加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀,按每1ml的数量分配到冻存管中。本公司按每个冻存管细胞数目大于1X106个细胞冻存。

三、应用

用于RTN4高表达对永生化胃粘膜上皮GES1细胞增殖的影响及机制研究:

为阐明其发生发展机制,课题组前期筛选出胃癌组织高表达差异蛋白质RTN4,进一步了解其在胃癌发病过程中的作用与机制,可为揭示胃癌发病的分子机制提供实验资料。

方法:

1、采用PCR方法构建p IRESneo3-RTN4真核表达载体,利用脂质体转染法将p IRESneo3-RTN4真核表达载体,转染永生化胃粘膜上皮GES1细胞,500mg/L G418筛选2周后汇合克隆,扩大培养,建立RTN4高表达GES1细胞系,即GES1-RTN4(GES1-p IRESneo3为载体对照)细胞;

2、通过细胞免疫荧光和Western-blot检测GES1-RTN4(GES1-p IRESneo3为载体对照)细胞中RTN4的表达;

3、运用细胞生长曲线、平皿克隆与软琼脂集落形成实验、流式细胞仪等,观察RTN4高表达对GES1细胞生长与增殖、周期与凋亡的影响。

4、采用Western-blot检测GES1-RTN4(GES1-p IRESneo3为载体对照)细胞中IκBα蛋白的表达。

结果:

1、细胞生长曲线结果显示:GES1-RTN4细胞的生长速度较GES1和GES1-p IRESneo3细胞明显加快,说明RTN4高表达后促进GES1细胞的生长与增殖(P<0.01);

2、平皿克隆形成实验结果显示:GES1、GES1-p IRESneo3和GES1-RTN4细胞的克隆数分别为56±8、65±12和128±21(个),GES1-RTN4细胞形成克隆数目较GES1和GES1-p IRESneo3细胞明显增多(P<0.01),且克隆体积大,说明RTN4高表达后,GES1细胞的克隆形成能力明显增加;

3、软琼脂集落形成实验结果显示:GES1、GES1-p IRESneo3和GES1-RTN4细胞的集落数分别为64±12、72±16和146±28(个),GES1-RTN4细胞形成的集落较GES1和GES1-p IRESneo3细胞明显增多(P<0.01),且集落体积大,说明RTN4高表达后GES1细胞的集落形成能力明显增加;

4、流式细胞仪检测结果显示:GES1细胞S期细胞比为45.63±4.62,G1期细胞比为49.57±8.49,细胞增殖指数为50.43;GES1-p IRESneo3细胞S期细胞比为30.10±6.28,G1期细胞比为48.75±7.86,细胞增殖指数为51.25;GES1-RTN4细胞S期细胞比为55.28±9.15,G1期细胞比为26.88±3.42,细胞的增殖指数为73.13。

说明RTN4高表达后GES1细胞中S期细胞比例明显增加,G1细胞比例降低,细胞增殖指数增加(P<0.01);同时,GES1、GES1-p IRESneo3和GES1-RTN4细胞的凋亡率降分别为24.65±4.58、24.43±3.36和17.52±1.23,说明RTN4高表达后,细胞的凋亡率降低(P<0.01)。

5、Western-blot结果显示:GES1-RTN4细胞中IκBα蛋白表达较GES1和GES1-p IRESneo3细胞减少(P<0.01)。

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