微生物菌种查询网是一个专为科研人员进行微生物菌种查询的技术型网站,由包括北京百欧博伟生物技术有限公司在内的多家企事业单位及院所共同打造!网站隶属于北京百欧博伟生物技术有限公司,并由其进行更新维护,会根据资源内容及菌种数量进行不定时更新,旨在讲最全面的微生物菌种信息呈现给广大微生物科研技术人员!
        从成立之日至今,微生物菌种查询网已收录并更新的国内外菌种资源达10万余株,其中,国内7万余株,国外2万余枚!网站也对细胞资源信息进行了收录,目前达到了国内外细胞资源总量超过1万余枚,基本可以满足大部分科研人员的查询需求!同时我们也罗列了5千余套培养基配方,部分已以文字的形式免费呈现在网站中!而且我们技术人员已经在对常用质粒载体进行设计构建,并且可提供查询的有400余枚!经过工作人员的不懈努力,网站中的资源信息每天都在增加,信息内容每天都在丰富,方便了大批需要进行微生物查询的科研技术人员,满足了众多企事业单位及科研院所的需求!

首页 / 研究动态 / HFL1(人肺成纤维细胞)的背景与应用!
HFL1(人肺成纤维细胞)的背景与应用!
小杨 / 2022-01-13


一、背景

HFL1(人肺成纤维细胞)是由H·Kuramoto于1968年分离的HEC-1-A细胞亚株。不同于HEC-A-1的是:HEC-1-B细胞在培养第135天到190天之间表现出稳定的生长周期,且重现扁平,与亲本细胞系相比更具铺路石样。此外,HEC-1-B细胞的主要染色体组是亲本细胞的两倍。

用75%的酒精消毒(建议配制75%酒精的水是灭菌过的)培养瓶外部。肉眼观察细胞培养基颜色,显微镜观察细胞生长情况,并对细胞进行不同倍数拍照(建议收到时的培养瓶拍一张照片,显微镜拍收到时的细胞100X,200X各一张)。显微镜观察细胞,当细胞融汇至80%左右(可以传代的情况下),细胞应该在37度培养箱预温1-2h后再做处理。如未达到细胞传代密度,培养瓶应预留一部分培养基继续培养。严格无菌操作,打开细胞培养瓶。

将细胞培养瓶内的培养基用吸管完全吸出(严禁直接倾倒),放入另一无菌容器中(建议换新的培养基培养细胞)。用PBS 2-3ml/次轻轻洗细胞表面,加入适量的0.05%胰酶-EDTA消化细胞,显微镜下观察细胞变圆,轻轻拍打培养瓶直到细胞脱落,加入终止液终止。1000rpm,5min离心,重悬细胞。换新的细胞培养瓶,37℃,5%CO2培养。

二、应用

用于SIRT6在肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化中的作用及机制研究:

人胚肺成纤维细胞(human fetal lung fibroblast,HFL1)为对象,研究SIRT6在HFL1细胞表型转化中的作用以及可能存在的分子机制,为寻找IPF有效的治疗靶点提供理论依据。

方法:采用Western blot检测不同浓度(1 ng/ml、2 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml和15 ng/ml)的转化生长因子(transforming growth factor-β1,TGF-β1)处理HFL1细胞24 h,以及5 ng/ml TGF-β1处理HFL1细胞不同时间(6 h、12 h、24 h、48 h和72 h)后SIRT6蛋白表达水平。

使用腺病毒过表达和shRNA沉默SIRT6后无血清处理HFL1细胞12 h,再用5 ng/ml TGF-β1处理细胞24 h,采用Western blot检测α-SMA、Collagen I、fibronectin和SIRT6蛋白表达水平。腺病毒过表达野生型和突变型SIRT6后无血清处理HFL1细胞12 h,再用5 ng/ml TGF-β1处理细胞30min,采用Western blot检测p-Smad2和p-Smad3蛋白表达水平,激光共聚焦扫描显微镜观察Smad2核转运的改变;5 ng/ml TGF-β1处理HFL1细胞30 min和60 min,采用免疫共沉淀检测SIRT6与NF-κB p65蛋白结合情况。

腺病毒过表达野生型和突变型SIRT6后无血清处理12 h,5 ng/ml TGF-β1处理HFL1细胞24 h,采用双荧光素酶报告基因系统检测NF-κB的转录活性,实时荧光定量PCR检测NF-κB靶基因IL-1β、IL-6、MMP9的表达水平。

结果:1、TGF-β1对HFL1细胞中SIRT6蛋白表达的影响:与对照组相比,2ng/ml和5 ng/ml TGF-β1处理HFL1细胞24 h后SIRT6蛋白表达水平显著上调(P<0.05),且浓度为5 ng/ml时达到最高水平。时间-效应关系实验表明5 ng/ml TGF-β1处理细胞12 h和24 h后SIRT6蛋白表达水平显著增加(P<0.05或P<0.01),且24 h时达到最高水平。

2、过表达和沉默SIRT6对肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的影响:5 ng/ml TGF-β1处理HFL1细胞24 h后α-SMA,collagen I和fibronectin蛋白表达水平显著上调(P<0.01)。过表达SIRT6后显著抑制TGF-β1诱导的α-SMA,collagen I和fibronectin蛋白表达水平(P<0.05或P<0.01)。但是沉默SIRT6后仅显著增加TGF-β1诱导的fibronectin蛋白的表达水平(P<0.05),α-SMA和collagen I蛋白表达没有改变。仅过表达或沉默SIRT6对HFL1细胞表型转化没有作用。

3、过表达SIRT6对TGF-β1/Smad2通路的作用:5 ng/ml TGF-β1处理HFL1细胞30 min后p-Smad2和p-Smad3蛋白表达水平显著上调。过表达SIRT6可显著抑制TGF-β1诱导p-Smad2蛋白表达水平(P<0.01),但对p-Smad3蛋白表达没有作用。无去乙酰化酶活性突变体SIRT6(H133Y)未能减弱TGF-β1诱导的p-Smad2蛋白表达水平。过表达野生型SIRT6显著抑制TGF-β1诱导的Smad2蛋白核转运,但突变体H133Y无此作用。

4、过表达SIRT6对NF-κB通路的作用:SIRT6与p65相结合,并在5 ng/ml TGF-β1处理HFL1细胞30 min后增强。过表达野生型SIRT6而非突变体H133Y显著抑制TGF-β1诱导的NF-κB转录活性(P<0.01),以及NF-κB靶基因IL-1β、IL-6、MMP9的表达(P<0.05或P<0.01)。

结论:TGF-β1处理HFL1细胞后,SIRT6蛋白表达呈现出一定的剂量和时间效应关系。过表达SIRT6通过抑制TGF-β1/Smad2和NF-κB信号通路削弱TGF-β1诱导的肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化,且依赖于SIRT6的去乙酰化酶活性。

  • 上一篇:P815小鼠肥大细胞瘤细胞的应用!