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WPMY-1人正常前列腺基质永生化细胞的应用!
小杨 / 2021-11-24


一、背景

WPMY-1人正常前列腺基质永生化细胞与RWPE-1 cells(ATCC CRL-11609)一样,来源于同一张成人前列腺组织切片的周围区域的基质细胞。

WPMY-1通过一个pRSTV质料结构,用SV40大T抗原对基质细胞进行永生化。WPMY-1细胞,与RWPE-1细胞及其它上皮细胞衍生株一样,属于来源于同一个前列腺的一系列细胞株。

由于它们来源于同一个前列腺的周围区域,WPMY-1细胞株对于研究分泌和基质与上皮细胞相互作用尤其有用。据提供者报道,来源于同一个前列腺的RWPE-1细胞株(ATCC CRL-11609),经过检测,乙肝、丙肝、人免疫缺陷病毒都呈阴性。

二、细胞培养操作

1、培养基及培养冻存条件准备:

1)准备DMEM培养基;优质胎牛血清,5%;双抗,1%。

2)培养条件:气相:空气,95%;二氧化碳,5%。温度:37℃,培养箱湿度为70%-80%。

3)冻存液:90%血清,10%DMSO,现用现配。

2、细胞处理:

1)复苏细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中(水面要低于冻存管盖部)摇晃解冻,移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2)细胞传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。

1.弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中,置于37℃培养箱中消化1-2分钟,然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加入3ml此细胞的培养基终止消化。

3.轻轻吹打后吸出,移入15ml离心管中,在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,加入1mL培养液后吹匀。

4.移入到事先准备好的含有5ml培养基的T-25培养瓶中或含有14ml培养基的T-75培养瓶中培养。

三、应用

用于锁掷酵母中圆酵母素和红酵母红素对前列腺疾病干预机制的研究:

首先建立了快速简洁纯化制备红酵母红素的方法,探究了圆酵母素及红酵母红素干预对H2O2诱导氧化损伤前列腺细胞的保护作用及其机制,并利用细胞模型及动物模型对两种类胡萝卜素干预对于前列腺癌(PCa)抑制作用及其机理进行了系统的研究。

结果如下:

1、本文利用酸热破壁、正己烷萃取得到了锁掷酵母发酵产物中的类胡萝卜素粗提物,随即利用硅胶柱分离并用体积比为V石油醚(3060°C沸程):V丙酮=3:12:11:1的洗脱剂将其梯度洗脱两次,得到了纯度95%以上可用于后续实验的红酵母红素。综合利用高效液相(HPLC)、液相质谱(LC-MS)、傅里叶红外光谱(FT-IR)、Raman光谱等分析手段鉴定红酵母红素的结构,同时对其光谱学数据进行了补充。

2、为探究圆酵母素及红酵母红素对氧化损伤的干预作用及其作用机制,建立了以H2O2诱导氧化损伤人正常前列腺基质永生化WPMY-1细胞为模型,从抗氧化能力以及抗凋亡损伤两个角度对两种类胡萝卜素的干预效果进行了评价。结果显示:圆酵母素及红酵母红素干预,不但可通过降低细胞内活性氧(ROS)的水平、提高内源性抗氧化酶系活性、减少丙二醛(MDA)的生成等途径提高机体内抗氧化系统清除自由基的能力,提高氧化受损WPMY-1细胞的存活率;还可以通过调节Bcl-2家族及Caspase家族相关基因的mRNA表达水平,减少氧化损伤引起的前列腺细胞的凋亡,从而降低受损伤细胞的死亡率。

3、为探究圆酵母素及红酵母红素对PCa的作用,用雄性激素依赖型PCa细胞LNCaP及雄性激素不依赖型PC-3细胞进行实验。利用圆酵母素及红酵母红素干预后,检测对细胞生存状况的影响发现:浓度范围10μM40μM内,圆酵母素对两种细胞的抑制作用与番茄红素的作用无显著性差异(P<0.05),而相同浓度下红酵母红素的抑制效果较二者则更为显著;且相对于激素依赖型LNCaP细胞而言,圆酵母素对于激素不依赖型PC-3细胞的抑制效果更为显著,而红酵母红素对两种细胞的抑制效果相近。

4、通过荧光染色、流式细胞分析、免疫印迹分析及荧光实时定量PCR(Q-PCR)分析等手段对圆酵母素及红酵母红素对于PCa细胞生长的抑制作用机理研究发现,该作用与线粒体途径介导的细胞凋亡有关。圆酵母素及红酵母红素首先通过上调了的p53基因特性调节Bcl-2家族相关基因的表达,活化Caspase家族相关因子,进而激活Caspase级联反应,引起细胞凋亡。

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