双歧杆菌作为一种重要的益生菌，被广泛应用在乳制品和微生态制剂生产中。本文围绕双歧杆菌在《伯杰氏系统细菌学手册》中的演化历史、最新分类，以及其多相分类法的应用进行了阐述，并对近年来双歧杆菌属的新种做了详细的介绍。
双歧杆菌是人和动物肠道内最主要的生理性细菌之一，它能产短链脂肪酸、维生素、细菌素、类抗生素，具有维持微生态平衡、生物拮抗、免疫调节、营养、协同降解多糖等多方面重要的生理功能。早期，关于双歧杆菌的分类学多以生理表型为准绳，但往往缺乏可靠性，特别是近缘物种间系统发育关系一直存有争议，以至于双歧杆菌的分类在《伯杰氏系统细菌学手册》(以下简称《伯杰氏手册》)中曾经过多次变动。而正确可靠的分类与鉴定不仅是分类学研究的主要目标，也是双歧杆菌开发应用和科学交流的基础。在过去，对双歧杆菌的分类及其性质的研究缺乏全面系统的总结和归纳，直到2012年5月新版《伯杰氏手册》第5卷(放线菌专刊)的面世，双歧杆菌分类学的研究才有了深入的发展。尤其是分子生物学的发展，各种分子标记的应运而生为分类学的研究注入了强劲的驱动力。但需指出的是，由于《伯杰氏手册》漫长的编辑时间，双歧杆菌在分类领域中又有了一些新的研究成果，其分类依据的阐述也不够清楚明确。因此，本文从《伯杰氏手册》的演化历史、最新分类出发阐述了其发展现状，并着重介绍和总结了双歧杆菌属的分类与最新进展。希望随着技术的进步双歧杆菌的分类学研究能够得到不断地完善。
伯杰氏手册中双歧杆菌分类地位的演变
双歧杆菌系1899年巴斯德研究院的Tissier首次在以母乳喂养的婴儿粪便中发现并分离出来，Tissier将这种分离到的革兰氏阳性、变弯的或分叉的杆菌命名为普通分叉杆菌(Bacillus bifiduscommunis)或分叉杆菌(Bacillus bfidus)。尽管1924年OrlaJensen提议将双歧杆菌分类作为一个独立的属，但伯杰氏第1−4版将其取名为Bacterodes bifidus，归到拟杆菌属(Bacteroides)中，又由于它与乳酸杆菌的相似性，伯杰氏第5−7版将其命名Lactobacillus bifidus，归类于乳杆菌属(Lactobacillus)。直到1974年，伯杰氏第8版才首次设立独立的双歧杆菌属(Bifdobacterium)，当时属内有11个种。1986年改名后第1版增至24个种。随着实验方法和研究设备的不断完善，又陆续发表了8个新种。在2012年新版《伯杰氏手册》中，双歧杆菌分类阶元为细菌域，放线菌门，纲Ⅰ放线菌纲，目Ⅲ双歧杆菌目(Bifidobacteriales)，1个科双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)，7个属，39个种。
伯杰氏手册中双歧杆菌的分类
2012年新版《伯杰氏手册》中，双歧杆菌目只包含1个双歧杆菌科，其分类主要是根据16S rRNA、热休克蛋白基因(hsp60)序列，以及recA[3]、ldh[4]、tuf [5]等多基因的分析比对，分成7个属，分别为双歧杆菌属(Bifidobacterium)、气斯卡多维亚氏菌属(Aeriscardovia)、异斯卡多维亚氏菌属(Alloscardovia)、加德纳氏菌属(Gardnerella)、另类斯卡多维亚氏菌属(Metascardovia)、类斯卡多维亚氏菌属(Parascardovia)、斯卡多维亚氏菌属(Scardovia)。
双歧杆菌属是双歧杆菌科中最大的一个属，分别来源于人类、动物、昆虫肠道以及人类龋齿、原料奶和污水。其分类鉴定结合了多种方法技术[6]，包括16S rRNA序列分析、脉冲电场凝胶电泳(PFGE)、荧光原位杂交(FISH)、特异性基因PCR扩增(recA等)、实时荧光定量PCR、扩增rDNA限制性酶切多态分析(ARDRA)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)等，多重技术从各个方面验证，使分类鉴定结果更加准确。2012年新版《伯杰氏手册》中双歧杆菌属含32个种(表 1)，其中，动物双歧杆菌含2个亚种，长双歧杆菌含3个亚种，假长双歧杆菌含2个亚种，嗜热酸性双歧杆菌含2个亚种。值得注意的是，《伯杰氏手册》只是保守的纳入了那些已确定的种属，有一些未分类的、不可培养的双歧杆菌目、科、属、种并未被编辑到其中。并且，在《伯杰氏手册》编辑完成后，新的研究中又有一些被提议列为双歧杆菌属的种，这将在下面进行阐述。
双歧杆菌分类依据
传统的分类和鉴定主要是根据表型的方法，这种单一的分类方法存在不足，导致双歧杆菌与产乳酸细菌、乳酸杆菌的分类模糊不清。目前，随着分子生物学的发展和各项新技术的应用，分类学家根据多相分类法[8, 9]，综合了双歧杆菌表型、遗传型、系统发育方面的各种信息，将分类单元准确描述到种水平。
表型信息指所有不以DNA或RNA分子为直接研究对象的信息，包括基本的生理生化特性，比如菌落菌体的形态、生长条件、营养要求、酶反应、糖发酵、代谢产物等，它可以将双歧杆菌鉴定到属以上的分类单元。其中，双歧杆菌独特的果糖-6-磷酸解酮酶代谢产乙酸、乳酸机制[10, 11]，成为其分类鉴定的主要指标之一。另外，在双歧杆菌的表型分类方法中，化学分类技术占有很重要的位置。双歧杆菌作为革兰氏阳性菌，其细胞壁含有各种类型的肽聚糖，并且是属于种特异的(表 1)，而脂类、磷脂是细菌细胞膜中脂双层的主要组分，脂肪酸是脂质和脂多糖的主要组成成分。因此，细胞化学组成成分的分析也是双歧杆菌分类的重要依据。
遗传型信息包括DNA的碱基组成(G+C%)、核酸的碱基组成和分子杂交、特殊基因的序列分析等。目前，16S rRNA序列的分析被作为双歧杆菌分类鉴定的重要指标，双歧杆菌属内种的比对结果为93%以上，日本鹤见大学Maasaki Okamoto教授等根据16S rRNA序列数据描绘了双歧杆菌的系统进化树[2]，从而简明地显示出双歧杆菌种属之间的进化关系。同时，有的研究学者利用23S rRNA及16S rRNA-23S rRNA间隔序列既具有保守性、又具有显著的可变性的特点，将其也结合到双歧杆菌的系统进化分析中[12, 13, 14, 15]。除此之外，其他一些高度保守基因，如编码延伸因子的tuf基因[5]、编码重组酶的recA基因[3]、groEL基因[16]、atp基因[17]等，也都被用于rRNA序列系统发育分析的支撑，作为亲缘关系较近的双歧杆菌亚种之间的区分的补充。另外，DNA杂交实验的测定，以及双歧杆菌作为高G+C含量的一类革兰氏阳性细菌的特点，也为其种和属的研究开辟了新的途径。DNA杂交技术主要是用于一些亲缘关系较近菌株的分析，在16S rRNA序列、表型特征难以区分鉴定的情况下，找出两个菌株的差异，因为两个菌株的16S rRNA序列比对结果即使为100%，其DNA杂合率也可能仅为70%或更低。
事实上，基于经典分子标记建立的系统发育关系也并非无懈可击。在以不同物种16S rRNA基因序列为数据集构建的系统发育树中，深枝存在自展值低的现象(通常＜70%，甚至更低)[18, 19]。近年来，在细菌基因组学的研究中掀起了一股全基因组测序的热潮，双歧杆菌分类学家也投入到这一研究当中，期待将其应用到双歧杆菌的多样性和系统发育分类学上。目前，完成全基因组测序的双歧杆菌有19个种、78个菌株(数据统计结果源自NCBI)，已有学者运用比较基因组的方法对双歧杆菌的分类进行了较多的研究[20, 21, 22, 23, 24, 25]。通过分析研究，我们从核苷酸水平、氨基酸水平、代谢水平上找到差异和共性，从重复基因、基因水平转移、基因丢失、染色体重排等基因组学信息上揭示了双歧杆菌适应新环境的演变，进而诠释了双歧杆菌种间的系统发育关系，构建出自展值高的进化树。相比之下，比较基因组学解决了传统分类学方法太过局限的问题，满足了双歧杆菌分类学快速发展的需求，这必将给双歧杆菌分类学的研究带来新的突破。
双歧杆菌的分类研究发展迅速，尽管多相分类法是细菌分类学里最有效的手段，但依然不能满足双歧杆菌分类学快速发展的需求。因此，发展和建立更新、更高效、更快捷的分类学方法已成为这门学科发展的客观需求。基因组涵盖了生物全部的遗传信息，通过比较基因组的运用，我们从基因、蛋白、代谢等各个层面揭示了远超过传统方法的大量的生物信息。这些信息不仅能为双歧杆菌的功能性质及代谢机制提供更深刻的见解，还能帮助研究学者理清双歧杆菌各分类单元的特征和进化关系，使其分类鉴定结果准确可信，也有利于更多新种的发掘和一些错误分类的纠正。而对这些新成果的分析与处理，则是《伯杰氏手册》双歧杆菌部分的一项重要工作。毫无疑问，比较基因组学已成为双歧杆菌分类学乃至整个分类学发展的一种趋势。此外，一些新技术的发展和应用也能够进一步推动分类学的发展，比如微生物蛋白组学技术。我们在这方面进行了一些探索性的研究，完成了一株长双歧杆菌的蛋白质组学参考图谱，并通过家兔结扎模型发现了双歧杆菌在体内外差异表达的基因和蛋白[33, 34]。由于蛋白质是生命活动的主要载体，微生物的表型差异往往都对应着蛋白质水平的差异，其中一些特殊的酶能从蛋白组上体现出重要的分类鉴定作用，比如双歧杆菌的果糖-6-磷酸解酮酶。如果将蛋白组学技术与比较基因组学分析结合起来应用到分类学上，我们就可从基因和蛋白水平上进行更全面、更系统的分类与鉴定。据此，有理由相信蛋白组学定能在分类学上发挥其积极作用。