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牛血清白蛋白的制备与制剂及检测方法!
小杨 / 2023-01-19


一、背景及概述

牛血清白蛋白是含581个氨基酸残基的多肽,理论计算的分子量为68kD,等电点为4.8。含氮量16%,含糖量0.08%,仅含己糖和己糖胺,含脂量只有0.2%。它由581个氨基酸残基组成,其中35个半胱氨酸组成17个二硫键,使分子呈9段弯曲,形成3个等体积的球状,在肽链的第34位有一自由巯基。牛血清白蛋白可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合。牛乳总蛋白中有1%-2%的蛋白为牛血清白蛋白,通过细胞间结合处进入牛乳,不具有特殊生理功能,但在乳成分分析检测领域中有重要作用。牛血清白蛋白在牛血液中约占50%,血液中的牛血清白蛋白主要起维持渗透压作用、PH缓冲作用、载体作用和营养作用。

二、制备方法

牛血清白蛋白提取方法,包括以下步骤:

1、血液分离

取新鲜的牛血液6000毫升,加入667毫升38%的柠檬酸三钠,使柠檬酸三钠在牛血液中的终重量浓度为3.8%,然后通过血球分离机(GFX-105血液分离机、辽阳翔隆制药机械有限公司),对牛血液进行分离(转速16300rpm/min),分离得到血细胞和血浆。

2、蛋白沉淀溶解

2.1取步骤1中的血浆4000毫升,加入6000毫升的饱和硫酸铵,使硫酸铵在血浆中的终浓度为60%,并搅拌1h,使血浆中的蛋白质沉淀,去除上清液,保留蛋白沉淀。

2.2按与蛋白沉淀的质量比为5:1的比例加入超纯水6000毫升,溶解上述蛋白沉淀,得到蛋白溶解液7000毫升。

3、第一次浓缩换液

通过超滤机对步骤2.2中得到蛋白溶解液进行超滤浓缩,超滤机上所用超滤膜包的超滤膜的截留分子量为5KD,调节超滤机的参数(MiniPellicon超滤系统、merkmillipore公司),流速为400ml/min、跨膜压为0.1psi,浓缩10倍,同时,用20mM、pH7.0的磷酸钠缓冲液进行换液。即用恒流泵将第一磷酸盐缓冲液加入到正在浓缩过程中的蛋白溶解液中,并通过恒流泵控制第一磷酸盐缓冲液的流速使蛋白溶解液的体积维持稳定,得到蛋白浓缩液700毫升。

4、第一次纯化

用层析纯化仪(APPSMV100D、利穗(苏州)科技有限公司)对上述蛋白浓缩液进行层析纯化,以二乙基氨基乙基-纤维素(二乙基氨基乙基离子交换介质)作为层析柱填料。上柱前,用20mM、pH7.0的磷酸钠缓冲液平衡,流速10ml/min,平衡体积5CV;平衡结束后,将蛋白浓缩液上柱层析,控制流速8ml/min;上样结束后,用平衡液平衡5CV,流速为10ml/min;用含1mol/L氯化钠的20mM、pH7.0的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱(从0%B到100%B拉梯度洗脱,共10CV),收集得到粗白蛋白溶液400ml毫升。洗脱后,用2mol/L的氯化钠溶液对层析柱进行再生处理。

5、第二次进行换液

通过超滤机对步骤4中得到粗白蛋白溶液进行超滤浓缩,超滤机上所用超滤膜包的超滤膜的截留分子量为5KD,调节超滤系统的参数,流速为400ml/min、跨膜压为0.1psi,用20mM、pH5.0的柠檬酸钠缓冲液进行换液。得到粗蛋白液600毫升。

6、第二次纯化

用层析纯化仪对上述粗蛋白浓缩液层析纯化,以磺丙基-纤维素(磺丙基离子交换介质)作为层析柱填料。上柱前,用20mM、pH5.0的柠檬酸钠缓冲液平衡,流速6ml/min,平衡体积10CV;平衡结束后,将蛋白浓缩液上柱层析,流速4ml/min,直接收集流出液,得到高纯度的低杂质含量的牛血清白蛋白溶液1000ml毫升。经冷冻干燥后记得到牛血清白蛋白粉。

三、纯化方法

单独使用硅藻土纯化牛血清白蛋白

用硅藻土纯化牛血清白蛋白(去除牛血清白蛋白中的核酸酶)时,使用的悬浮液为Tris-HCl缓冲溶液,浓度为50mM,pH为7.8;使用的透析液为Tris-HCl缓冲溶液,浓度为10mM,pH为8.0;硅藻土以及悬浮液使用前在121℃条件下灭菌30min。具体的纯化步骤为:

(1)将6g硅藻土用60mL悬浮液(硅藻土与悬浮液的比例为1:10w/v)混合,置于100℃沸水浴中5min,室温条件下搅拌5min,5000rpm离心10min,丢弃上清液;重复上述洗涤步骤3次后,将洗涤后的硅藻土在60mL悬浮液中分散均匀,得到吸附剂分散液,在4℃条件下储存备用;

(2)将2.5g牛血清白蛋白在12.5mL悬浮液中(牛血清白蛋白与悬浮液的比例为1:5w/v)溶解分散均匀,加入18.75mL吸附剂分散液,在4℃搅拌30min后,在该温度下10000rpm离心10min,收集上清;

(3)在上清液中加入18.75mL吸附剂分散液(牛血清白蛋白悬浮液与吸附剂分散液的比例为1:1.5v/v),在4℃搅拌30min,在该温度10000rpm离心10min,收集上清液;再重复一次;

(4)收集的上清用0.45μm膜过滤后,即得牛血清白蛋白纯化液;

(5)采用分子截留量为10KD的超滤浓缩管2500rpm离心20min,对蛋白浓度进行超滤浓缩,得到超滤牛血清白蛋白样品;

(6)将超滤牛血清白蛋白样品采用分子截留量为14000Da的透析袋4℃条件下搅拌透析2h后,更换透析液透析过夜,超滤牛血清白蛋白样品与透析液的体积比为1:15;

(7)透析后的样品测定蛋白浓度后,稀释至10mg/ml,分装成1mL/支,保存于-20℃。

四、制剂

一种制备牛血清白蛋白纳米微球的方法,其步骤包括:

(1)配制浓度为10mM的氯化钠水溶液,将100牛血清白蛋白溶解于5ml氯化钠溶液,

(2)将4mg双端马来酰亚胺化聚乙二醇溶解于1ml氯化钠溶液中,氩气保护下滴加到牛血清白蛋白溶液中,室温下搅拌2小时,

(3)室温搅拌下滴加浓度为1N的氢氧化钠溶液,调节混合溶液pH值为7,

(4)室温搅拌下滴加6倍体积的丙酮或乙醇,至溶液混浊;

(5)高速离心得到纳米微球,随后分别用蒸馏水、无水乙醇清洗,最后冷冻干燥得到牛血清白蛋白纳米微球。

五、检测方法

检测牛乳中牛血清白蛋白含量的方法包括如下步骤:

(a)配制标准溶液,制订标准曲线:

将牛血清白蛋白标准品溶于样品缓冲液,配制浓度分别为4mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.01mg/ml的标准溶液。精确提取40μl标准溶液加入样品管中,超声波清洗3min后使用高压毛细管电泳分析仪分析。积分后的峰面积分别为57568、29684、15481、7125、148,利用软件得出标准曲线,线性回归相关系数为0.9993,最低检出限为0.1ng,最低检出含量为0.01mg/ml,标准样品回收率达90%。

(b)检测待测牛乳:

把奶样品加入15ml的离心管中,在5000r/min离心条件下离心10min,离心温度为4℃,然后准确提取100μl置于2ml离心管中(或其他容器),提取400μl样品缓冲液加入2ml离心管中稀释5倍,使用漩涡混合器混匀。精确提取40μl上述处理样品加入样品管中,放置于超声波清洗机3min,之后使用高压毛细管电泳分析仪测定。

上述步骤(a)和(b)中,处理样品缓冲液配置方法:在1体积份150mmol/L的三甲基氨基甲烷缓冲液中加入4体积份50mmol/L的乙二胺四乙酸二钠、4体积份5mol/L的尿素、4体积份2mg/ml的二硫基苏糖醇、4体积份0.03%的甲基羟乙基纤维素,使用氢氧化钠溶液把pH值调至8.5。

上述步骤(a)和(b)中,高压毛细管电泳分析仪的电泳温度控制在35℃,使用直径为50μm、长度为200mm的涂层石英毛细管柱,紫外线检测器,压力进样,压力为0.5psi,时间为10s,分离温度为15℃,工作电压为17kV。

上述步骤(a)和(b)中,电泳缓冲液的配置方法:柠檬酸缓冲液,pH值为3.0。

(c)样品定量读数:

根据样品分离的图谱,运用高压毛细管电泳分析仪所带的分析软件,积分牛血清白蛋白的峰面积为1035,利用分析软件自动套入标准曲线方程内计算出试样浓度为0.067mg/ml,再乘稀释倍数5,即得实际浓度为0.335mg/ml,所以该牛奶样品含有的牛血清白蛋白浓度为0.335g/L。

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