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动物源性食品中细菌的检测——志贺氏菌
小杨 / 2023-01-19


志贺氏菌属(Shigella)是一类革兰氏阴性杆菌,是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌,是发展中国家的常见病、多发病,严重危害着人类的健康,尤其是儿童的生长发育。全世界每年死于志贺氏菌感染的人数约为60万。1994—1997年的监测资料表明,我国年报告志贺氏菌感染病例在60万~85万,该菌引起的发病率居甲、乙类传染病之首,病死率为0.04%~0.07%。志贺氏菌致病性强,10~100个细菌细胞就可使人发病,临床分离的菌株多数为多重耐药性。

1 病原学特征

志贺氏菌属为直杆菌,大小为(0.5~0.7)μm×(2~3)μm,无芽孢,无荚膜,无鞭毛,多数有菌毛。革兰氏染色阴性(图2-6),不运动,需氧或兼性厌氧。对营养的要求不高,能在普通培养基上生长,最适温度为37℃,最适pH为6.4~7.8。37℃培养18~24h后菌落呈圆形、微凸、光滑湿润、无色、半透明、边缘整齐,直径约2nm,宋内氏志贺氏菌菌落一般较大,较不透明,并常出现扁平的粗糙型菌落。在液体培养基中呈均匀浑浊生长,无菌膜形成。该菌属都能分解葡萄糖,产酸不产气。大多不发酵乳糖,仅宋内氏志贺氏菌迟缓发酵乳糖。靛基质产生不定,甲基红试验阳性,VP试验阴性,不分解尿素,不产生硫化氢。

1.1 分类

志贺氏菌属有K和O抗原而无H抗原。K抗原是新分离的某些菌株的菌体表面抗原,不耐热,加热100℃经1h被破坏。K抗原在血清学分型上无意义,但可阻止O抗原与相应抗血清的凝集反应。O抗原分为群特异性抗原和型特异性抗原,前者常在几种近似的菌种间出现;型特异性抗原的特异性高,用于区别菌型。根据志贺氏菌抗原构造的不同,可分为四群48个血清型(包括亚型)。

1.1.1 A群

又称痢疾志贺氏菌(Sh.dysenteriae),通称志贺氏痢疾杆菌。不发酵甘露醇。有12个血清型,其中8型又分为3个亚型。

1.1.2 B群

又称福氏志贺氏菌(Sh.flexneri),通称福氏痢疾杆菌。发酵甘露醇。有15个血清型(含亚型及变种),抗原构造复杂,有群抗原和型抗原。根据型抗原的不同,分为6型,又根据群抗原的不同将型分为亚型;X、Y变种没有特异性抗原,仅有不同的群抗原。

1.1.3 C群

又称鲍氏志贺氏菌(Sh.boydii),通称鲍氏痢疾杆菌。发酵甘露醇,有18个血清型,各型间无交叉反应。

1.1.4 D群

又称宋内氏志贺氏菌(Sh.sonnei),通称宋内氏痢疾杆菌。发酵甘露醇,并迟缓发酵乳糖,一般需要3~4d。只有1个血清型。有2个变异相,即Ⅰ相和Ⅱ相;Ⅰ相为S型,Ⅱ相为R型。

根据志贺氏菌的菌型分布调查,我国一些主要城市在过去二三十年中均以福氏菌为主,其中以又2a亚型、3型多见;其次为宋内氏菌;志贺氏菌与鲍氏菌则较少见。志贺氏菌Ⅰ型的细菌性痢疾已发展为世界性流行趋势,我国至少在10个省份发生了不同规模流行。

1.2 抵抗力

志贺氏菌属在外界环境中的生存力,以宋内氏志贺氏菌最强,福氏志贺氏菌次之,痢疾志贺氏菌最弱。一般在潮湿土壤中能存活34d,在37℃水中可存活20d,在冰块中可存活96d,在粪便内(室温)可存活11d。日光直接照射30min、56~60℃经10min即被杀死,对高温和化学消毒剂很敏感,在1%石炭酸中15~30min即被杀死,对氯霉素、磺胺类、链霉素敏感,但易产生耐药性。

1.3 变异性

1.3.1 S-R型变异

菌落可由光滑型变为粗糙型,宋内氏志贺氏菌易由S型变为R型,当菌落变异时,常伴有生化反应、抗原构造和致病性的改变。在机体内,尤其在慢性患者和恢复期患者体内,志贺氏菌可发生变异而失去原来的生化和抗原特性,成为不典型菌株。

1.3.2 毒力变异与其他变异

1963年南斯拉夫Mel首先创用依赖链霉素的志贺氏菌株(依链株,Sd),作为口服菌苗可预防志贺氏菌痢疾。Sd株是一株必须有链霉素存在才能生长的菌株,其毒力减弱但仍保持免疫原性。

2 致病性

志贺氏菌引起的细菌性痢疾主要通过消化道途径传播。根据宿主的健康状况和年龄,有时只需少量病菌(至少为10个细胞)进入,就有可能致病。

致病因素:志贺氏菌的致病作用主要是侵袭力、内毒素、外毒素。

侵袭力:志贺氏菌进入大肠后,由于菌毛的作用黏附于大肠黏膜的上皮细胞上,继而进入上皮细胞并在其内繁殖,扩散至邻近细胞及上皮下层。由于毒素的作用,上皮细胞死亡,黏膜下发炎,并有毛细血管血栓形成,以致使黏膜坏死、脱落,形成溃疡。志贺氏菌一般不侵犯其他组织,偶尔可引起败血症。目前认为,不论是产生外毒素的还是只有内毒素的志贺氏菌必须侵入肠壁才能致病。因此对黏膜组织的侵袭力是决定致病性的主要因素。

内毒素:志贺氏菌属中各菌株都有强烈的内毒素,作用于肠壁,使通透性增加,从而促进毒素的吸收。继而作用于中枢神经系统及心血管系统,引起临床上一系列毒血症症状,如发热、神志障碍,甚至中毒性休克。毒素破坏黏膜,形成炎症、溃疡,呈现典型的痢疾脓血便。毒素作用于肠壁植物神经,使肠道功能紊乱,肠蠕动共济失调和痉挛,尤以直肠括约肌最明显,因而发生腹痛、里急后重等症状。

外毒素:志贺氏菌A群Ⅰ型及部分Ⅱ型菌株还可产生外毒素,称志贺毒素。为蛋白质,不耐热,75~80℃经1h被破坏。该毒素具有三种生物活性:①神经毒性,给家兔或小鼠注射毒素,毒素作用于中枢神经系统,引起四肢麻痹、死亡;②细胞毒性,对人肝细胞、猴肾细胞和HeLa细胞均有毒性;③肠毒性,具有类似大肠杆菌、霍乱弧菌肠毒素的活性,可以解释疾病早期出现的水样腹泻。

3 流行病学特征

道我国每年约有14000例志贺氏菌病,但发病人数约为30万。

据美国食品药品监督管理局(FDA)统计,1997年美国加利福尼亚州等5个州食源性疾病共为8051例,其中志贺氏菌引起的为1263例。

志贺氏菌病常为食物暴发型或经水传播。和志贺氏菌病相关的食品包括色拉,生的蔬菜、奶和奶制品、禽肉、水果、面包、汉堡包及有鳍鱼类。志贺氏菌在拥挤和不卫生条件下能迅速传播,经常发现于人员大量集中的地方,如餐厅、食堂。食源性志贺氏菌流行的最主要原因是从事食品加工行业人员患痢疾或带菌者污染食品,食品接触人员个人卫生差,存放已污染的食品温度不适当等。

4 危害

细菌性痢疾是最常见的肠道传染病,夏秋两季患者最多。传染源主要为病人和带菌者,通过污染了痢疾杆菌的食物、饮水等经口感染。人类对志贺氏菌易感,10~200个细菌可使10%~50%的人致病。一般说来,痢疾志贺氏菌所致痢疾的病情较重;宋内氏志贺氏菌引起的症状较轻;福氏志贺氏菌介于二者之间,但排菌时间长,易转为慢性。

1999年5月15日,福建省三明市梅列区一幼儿园发生了由宋内氏志贺氏菌引起的食物中毒事件。在24h内发病37例,患儿年龄5~7岁。2007年甘肃省武威市307名儿童集体食物中毒事件是由痢疾志贺氏菌污染造成的。2006年,四川崇州200名小学生发生了痢疾志贺氏菌食物中毒事件。

5 检测方法

5.1 分离培养

增菌:称取待检样品25g,加入装有225mL志贺氏菌增菌肉汤的500mL广口瓶内,固体食品应用均质器以8000~10000r/min打碎1min,或用乳钵加灭菌砂磨碎,粉状食品应用灭菌金属匙或玻璃棒研磨使其乳化,于(36±1)℃培养6~8h。

分离培养:取增菌液1环,划线接种于志贺氏菌选择性琼脂平板或志贺氏菌显色培养基上,于(36±1)℃培养18~24h。观察平板或培养基上菌落形态,根据志贺氏菌在不同培养基上的菌落特征进行可疑菌落的判定。

5.2 生化鉴定

挑取平板上的可疑菌落,接种三糖铁琼脂和半固体各一管。志贺氏菌属在三糖铁琼脂内的反应结果为底层变黄、不产气(福氏志贺氏菌6型可微产气),斜面不变色,不产生硫化氢,无动力;在半固体管内沿穿刺线生长。应进一步做苯丙氨酸脱氨酶、赖氨酸脱羧酶,西蒙氏柠檬酸盐和葡萄糖铵尿素、KCN、水杨苷、七叶苷试验,志贺氏菌属均为阴性反应。必要时应做革兰氏染色检查和氧化酶试验,应为氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌,并以生化试验方法做4个生化群的鉴定。具有以上特性的菌株,疑为志贺氏菌,可做血清凝集试验。

5.3 血清学分型

挑取三糖铁琼脂上的培养物,做玻片凝集试验。先用4种志贺氏菌多价血清检查,如果由于K抗原的存在而不出现凝集,应将菌液煮沸后再检查,再用A1、A2、B群、多价D群血清分别试验,如系B群福氏志贺氏菌,则用群和型因子血清分别检查,确定菌型。福氏志贺氏菌型鉴定的方法:可先用群因子血清检验,再根据群因子血清出现凝集的结果,依次选用型因子血清检查。4种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株,可用鲍氏志贺氏菌多价血清1、2、3分别检查,并进一步用1~15各型因子血清确定菌型,如果不是鲍氏志贺氏菌,可用痢疾志贺氏菌3~12型多价血清及各型因子血清检查。

5.4 分子生物学鉴定

5.4.1 DNA模板的制备

取增菌液1mL于小离心管中,4000~5000r/min离心5min,弃上清液,向菌沉淀中加入50μL灭菌纯水制成菌悬液,混匀后100℃煮沸10min,12000r/min离心5min,取上清液作为PCR模板。

5.4.2 引物设计

上游引物为5′-GTTCCTTGACCGTTCCGATACCGTC-3′;下游引物为5′-GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTAC-3′。扩增片段长度为629bp。

5.4.3 PCR反应体系

反应体积25μL:10×buffer2.5μL,TaqDNA聚合酶(2U/μL)0.5μL,MgCl2溶液(25mmol/L)3μL,dNTP(25mmol/L)1μL,ddH2O14μL,上游引物(10μmol/L)1μL,下游引物(10mol/L)1μL,模板2μL。

5.4.4 PCR反应参数

95℃预变性5min;95℃变性15s,65℃退火30s,72℃延伸30s,35个循环;72℃后延伸5min。4℃保存。

注:PCR反应参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当调整。

5.4.5 电泳

用核酸电泳缓冲液(TAE)制备1.8%~2.0%的琼脂糖凝胶,取5μLPCR扩增产物,分别和2μL上样缓冲液混合进行点样,用DNA分子量标记物做参照,3~5V/cm恒压电泳,电泳20~40min,电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。

5.4.6 结果判定

在阴性对照未出现条带、阳性对照出现预期大小的扩增条带条件下,如待测样品未出现629bp大小的扩增带,则判为阴性;如待测样品出现629bp大小的扩增带,则判为阳性。

如果阴性对照和(或)阳性对照未出现预期大小的扩增条带,则本次检测结果无效,应重新试验。

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