AtT20（小鼠垂体瘤细胞）的培养操作及应用！
小杨 / 2024-02-21 08:49:56
一、背景
AtT20是一种来源于小鼠垂体腺瘤的细胞系，常用于研究垂体腺瘤的生物学特性、药物筛选和治疗策略。该细胞系具有以下特点：
来源：
AtT20细胞系来源于小鼠垂体腺瘤组织，经过多次传代和筛选，形成了一个相对稳定的细胞系。
形态特征：AtT20细胞呈多边形或长条形，大小约为15-30微米，胞质丰富，核大而圆，核仁明显。
生长特性：AtT20细胞生长迅速，传代周期约为24-48小时，可在含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中稳定生长。
激素分泌特性：AtT20细胞具有垂体腺瘤的典型激素分泌特性，如生长激素、促甲状腺激素等，可用于研究垂体腺瘤相关的激素分泌异常。
其他特性：AtT20细胞还具有一定的增殖能力，可用作研究垂体腺瘤细胞增殖相关疾病的模型。
1)复苏AtT20细胞系：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)AtT20细胞系传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)AtT20细胞系冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。
下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
三、应用
AtT20可以用于丙戊酸钠联合替莫唑胺对小鼠垂体腺瘤细胞AtT20、GT1-1凋亡的促进作用及其机制研究：
探讨替莫唑胺联合丙戊酸钠对小鼠垂体腺瘤细胞AtT20、GT1-1增殖的抑制作用以及凋亡的促进作用,并探讨其可能的分子机制。
方法：
1、细胞培养:小鼠垂体腺瘤细胞AtT20、GT1-1培养于含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM/High Glucose培养基中,放置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养,视细胞生长状态,间隔约1-2天半量换液一次,3天左右1:3传代一次。取对数生长期的细胞进行实验。
2、TMZ与VPA对AtT20、GT1-1细胞增殖的影响。取对数生长期的AtT20、GT1-1细胞,将细胞分为(1)AtT20细胞TMZ组:向细胞中分别加入不同浓度(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2mM)TMZ,并分别培养24、48、72h;(2)AtT20细胞VPA组:向细胞中分别加入不同浓度(2、4、8、16、32、64mM)VPA,并分别培养24、48、72h;(3)GT1-1细胞TMZ组:向细胞中分别加入不同浓度TMZ(浓度同前),并分别培养24、48、72h;(4)GT1-1细胞VPA组:向细胞中分别加入不同浓度VPA(浓度同前),并分别培养24、48、72h,通过CCK-8法检测TMZ与VPA各自对AtT20、GT1-1细胞增殖的影响。
3、TMZ与VPA联合应用对小鼠垂体腺瘤细胞AtT20、GT1-1细胞活性的影响。取对数生长期的AtT20、GT1-1细胞,将细胞分为(1)对照组(加入等量完全培养基);(2)TMZ组(加入1.6mMTMZ);(3)VPA组(加入16mMVPA);(4)TMZ+VPA组(加入1.6mM TMZ以及加入16mM VPA)。药物处理72h后,通过LDH法检测TMZ与VPA联合应用对AtT20、GT1-1细胞活性的影响。
4、TMZ与VPA联合应用对小鼠垂体腺瘤细胞AtT20、GT1-1细胞凋亡的影响。取对数生长期的AtT20、GT1-1细胞,按照上述分组,分别给予完全培养基、TMZ以及VPA,药物处理72h后,通过TUNEL染色、流式细胞计数检测TMZ与VPA联合应用对AtT20、GT1-1细胞凋亡的影响;通过Hoechst 33258染色检测TMZ与VPA联合应用对AtT20、GT1-1细胞形态学的影响。
5、TMZ与VPA联合应用对小鼠垂体腺瘤细胞AtT20、GT1-1细胞凋亡影响的分子机制。取对数生长期的AtT20、GT1-1细胞,按照上述分组,分别给予完全培养基、TMZ以及VPA,药物处理72h后,通过Western blot检测TMZ与VPA联合应用对AtT20、GT1-1细胞cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、Bax、Bcl-2、AIF、cleaved PARP、p53等凋亡相关蛋白表达水平的影响。
结果：
1、TMZ与VPA对AtT20、GT1-1细胞增殖的影响。CCK-8法检测结果显示:TMZ、VPA分别作用于AtT20、GT1-1细胞后,细胞增殖与对照组相比明显抑制且具有统计学意义(p<0.05),TMZ、VPA对细胞增殖具有显著的抑制作用,且呈现明显的剂量依赖性与时间依赖性。
2、TMZ与VPA联合应用对小鼠垂体腺瘤细胞AtT20、GT1-1细胞活性的影响。LDH法检测结果显示:TMZ、VPA分别作用于AtT20、GT1-1细胞后,细胞活性与对照组相比明显降低且具有统计学意义(p<0.05),TMZ与VPA联合应用后细胞活性进一步降低,结果具有统计学意义(p<0.05)。
3、TMZ与VPA联合应用对小鼠垂体腺瘤细胞AtT20、GT1-1细胞凋亡的影响。TUNEL染色、流式细胞计数结果显示:TMZ、VPA分别作用于AtT20、GT1-1细胞后,细胞凋亡水平与对照组相比显著升高,结果具有统计学意义(p<0.05)TMZ与VPA联合应用后细胞凋亡水平进一步升高,结果具有统计学意义(p<0.05)。Hoechst 33258染色结果显示:TMZ、VPA分别作用于AtT20、GT1-1细胞后,表现为均匀弥散染色的细胞核(活细胞核)数量减少,浓染致密的颗粒块状荧光(凋亡细胞核)数量增多,细胞凋亡水平与对照组相比显著升高,TMZ与VPA联合应用后凋亡水平进一步升高。
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