蜂房小甲虫PCR试剂盒的特点与应用及操作步骤！
小杨 / 2024-02-20 08:59:51
一、背景
蜂房小甲虫PCR试剂盒通常包括引物、酶、DNA模板等反应成分，以及PCR仪等反应设备。使用时，将待测样本加入试剂盒中，按照说明书上的操作步骤进行PCR反应，最终得到检测结果。
蜂房小甲虫（Aethina tumida）是蜂群的寄生虫。它的成虫和幼虫以蜂子、蜂蜜和蜂花粉为食,导致幼蜂死亡、蜂蜜发酵及巢脾被破坏。小甲虫加速破坏蜂巢,使成年蜜蜂逃逸。其损害程度可能取决于气候条件等因素,相比温度和湿度较低的地区,蜂房小甲虫在较高的温度和高湿度下的危害一般更大。蜂蜜提纯设备也是蜂房小甲虫潜在的繁殖场所,一旦蜂房小甲虫出现在这种设备中,这种危害会更严重。从卵发育到成虫,蜂房小甲虫需要3~12周,周期长短取决于湿度、温度和食物供应。成虫飞行时所到之处,所有规模的蜂群都会被侵扰，因此蜂房小甲虫的快速检测具有重要的意义。
1、准备样品：将待测样本进行预处理，如DNA提取、纯化等步骤，以便后续的PCR反应。
2、设计引物：根据蜂房小甲虫的特异性基因序列，设计一对引物，用于PCR反应的扩增。
3、配置反应液：将PCR反应液进行配置，包括DNA模板、引物、dNTPs等反应成分。
4、设定PCR仪程序：根据试剂盒说明书上的设定程序，将PCR仪进行设定，如循环次数、反应温度等。
5、进行PCR反应：将配置好的反应液加入PCR仪中，按照设定的程序进行PCR反应。
6、分析结果：在PCR反应结束后，对结果进行分析，如出现特异性的扩增产物，则可判断样本中存在蜂房小甲虫的DNA。
三、应用
开展了中华豆芫菁的全基因组测序,通过比较基因组学分析,获得了芫菁科特有并在中华豆芫菁中显著扩张的基因家族;从全基因组水平分析了可能与斑蝥素合成及转运相关的基因家族,进一步筛选了芫菁科特有的细胞色素P450(Cytochrome P450,CYP450),并对1个芫菁科特有的CYP450(EchiCYP72)进行了与斑蝥素合成相关性的验证。
主要研究结果如下：
(1)中华豆芫菁全基因组测序与比较基因组分析通过PacBio三代测序平台对中华豆芫菁进行高通量测序,得到151.88 Mb的基因组数据并绘制了基因组草图(GC含量为33.08%,contig数量为870条,N50长度为659.43 Kb,最长的scaffold为5.89 Mb),注释得到12,520个高质量编码蛋白基因。使用BUSCO软件对中华豆芫菁基因组完整性评估,结果显示基因组完整度、重复率、缺失率分别为98.7%、2.9%、0.9%。比较基因组分析和富集分析的结果显示发现气味受体(Odorant receptor)、CYP450等45个基因家族发生了显著的扩张。通过对以往研究的分析,发现CYP450家族与斑蝥素的生物合成有很大的相关性。
(2)芫菁科特有CYP450和蜂房小甲虫PCR试剂盒的鉴定与分析鉴定了赤拟谷盗(Tribolium castaneum)蜂房小甲虫(Aethina tumida)、光肩星天牛(Anoplophora glabripennis)、米象(Sitophilus oryzae)、中欧山松大小蠹(Dendroctonus ponderosae)、马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)、白蜡窄吉丁虫(Agrilus planipennis)等7种不产生斑蝥素的甲虫和眼斑沟芫菁(Hycleus cichorii)、大斑沟芫菁(Hycleus phaleretus)、中华豆芫菁等3种芫菁科昆虫的CYP450,共得到899个CYP450(其中包含116个中华豆芫菁的CYP450)。通过本地双向Blast得到25个芫菁科特有的CYP450,分别属于CYP4亚族和CYP3亚族的CYP6和CYP9。发现芫菁科昆虫特有的CYP450中仅有EchiCYP72基因属CYP9,且前人未曾验证过CYP9与斑蝥素合成的相关性。
(3)EchiCYP72基因与斑蝥素合成相关性的验证为了验证EchiCYP72基因与斑蝥素合成的相关性,利用蜂房小甲虫PCR试剂盒RT-q PCR技术确定该基因在中华豆芫菁雄虫不同时期和不同组织的表达量,并通过RNAi技术结合RT-q PCR和气相色谱仪检测了干扰该基因后对斑蝥素合成的影响。结果显示注射该基因的ds RNA后显著抑制了EchiCYP72基因的表达,干扰效率可达74.05%以上,最高为94.04%,且1d、3d、5d、7d后的斑蝥素含量分别被抑制了49.12%、31.67%、40.59%、60.59%,说明该基因与斑蝥素的合成存在较强的相关性。
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