驽巴贝斯虫PCR试剂盒的背景与应用及培养操作！
小杨 / 2024-01-15 08:51:51
一、背景
驽巴贝斯虫PCR试剂盒一种用于检测驽巴贝斯虫的生物试剂盒，采用PCR技术进行检测。该试剂盒可以在动植物体外对特定基因（DNA）片段进行快速酶促扩增，经过多个循环扩增，检测扩增产物中的特定基因，从而实现对驽巴贝斯虫的检测。
驽巴贝斯虫是一种寄生虫，可以感染人类和动物，引起疟疾、腹泻等症状。
驽巴贝斯虫PCR试剂盒包含PCR反应体系、引物、荧光探针等成分，可以扩增出驽巴贝斯虫的DNA片段，并通过荧光信号检测来确定是否存在驽巴贝斯虫感染。
使用驽巴贝斯虫PCR试剂盒时，需要从患者或动物样本中提取DNA，并将其加入到PCR反应体系中进行扩增。如果样本中存在驽巴贝斯虫的DNA，则PCR反应会产生荧光信号，从而可以确定是否存在感染。
1、样本处理：将待检样本的核酸提取，可以使用病毒RNA提取试剂盒或自动化核酸提取仪等。
2、准备试剂：按照试剂盒说明书中的指示，准备所需的试剂和材料，例如PCR反应液、引物、DNA模板等。
3、配置反应体系：根据试剂盒说明书中的指示，配置PCR反应体系，包括PCR反应液、引物、DNA模板等。
4、设定PCR程序：根据试剂盒说明书中的指示，设定PCR程序，包括变性、退火、延伸等温度和时间。
5、运行PCR程序：将配置好的PCR反应体系放入PCR仪中，运行设定的PCR程序。
6、结果分析：在PCR程序运行结束后，对扩增产物进行电泳或其他方法检测，以判断是否扩增出特定基因片段，从而实现对驽巴贝斯虫的检测。
三、应用
马驽巴贝斯虫病病原为驽巴贝斯虫,该病是一种经由媒介蜱虫传播的严重影响马属动物健康的血液原虫病,被世界卫生组织(OIE)列为法定报告检疫疫病,在我国该病被列为二类动物疫病。该病呈全球性发生,患马呈现发热、贫血、黄疸、血红蛋白尿,急性病例死亡,亚急性、慢性病例终身成为带虫宿主,造成本土马与引进马互相感染、反复发病,给马养殖业造成重大损失。目前尚无该病的有效治疗药物及疫苗,故研发新型检测技术是有效的防控途径,可及时检测、监控和综合防治,有利于马产业的健康发展。
使用驽巴贝斯虫PCR试剂盒并根据GenBank中的驽巴贝斯虫(Babesia caballi)Bc48基因序列设计了一对特异性引物,建立检测驽巴贝斯虫的二温式PCR方法。该方法能够特异地扩增155 bp的片段,与双芽巴贝斯虫、环形泰勒虫、马泰勒虫、瑟氏泰勒虫均无交叉反应,能检测到的最低DNA拷贝数为5.17×102 copies/μL。应用所建立的方法检测了采集于和静县焉耆马匹样品(N=82),结果显示,马驽巴贝斯虫感染率69.51%(57/82),与血液涂片检查结果37.8%(31/82)相比,其检出率更高。该驽巴贝斯虫PCR试剂盒二温式PCR检测方法具有较高的特异性和敏感性,可用于马驽巴贝斯虫的早期诊断。
(Ⅱ)根据Bc48保守部分基因序列设计合成特异性引物和MGB荧光探针,建立了驽巴贝斯虫病的MGB FQ-PCR检测方法。对所建立的FQ-PCR检测方法进行特异性、灵敏性和重复性试验,并分别用FQ-PCR检测方法和普通PCR方法对临床样品进行检测对比。结果显示,该方法灵敏度高,最小检出量为5.17×101copies/μL的标准质粒,比常规PCR灵敏100倍;建立的FQ-PCR检测方法标准曲线的循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.9996,重复性好,组内与组间重复性试验的变异系数分别为0.7%和0.42%,均小于1%;该方法能特异性检测驽巴贝斯虫,而对马泰勒虫、双芽巴贝斯虫、环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫等病原检测结果均为阴性。用建立的MGB-FQ PCR和使用驽巴贝斯虫PCR试剂盒的常规PCR分别对90份临床样品进行检测,MGB-FQ PCR和常规PCR检出率分别为53%和30%。本次建立的驽巴贝斯虫病MGB-FQ PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于马驽巴贝斯虫病临床样品诊断、流行病学调查,将为蜱传马梨形虫病的检测提供新的方法。
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