一、背景
人胚肾上皮包装细胞是在293细胞株上插入免疫缺陷病毒SV40 T-抗原基因后产生的高转染效率衍生株，广泛用于包装慢病毒，其转染效率比293细胞高很多，是研究基因功能的一个强大工具。
二、人胚肾上皮包装细胞培养操作规程
1、人胚肾上皮包装细胞培养基及培养冻存条件准备：
1）准备DMEM培养基(DMEM，GIBCO，货号11965-092)，90%；胎牛血清，10%。
2）人胚肾上皮包装细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。
3）人胚肾上皮包装细胞冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。液氮储存。
2、人胚肾上皮包装细胞处理：
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。
2）人胚肾上皮包装细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3ml此细胞的培养基终止消化。
3.轻轻吹打后吸出，移入15ml离心管中，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养液后吹匀。
4.移入到事先准备好的含有5ml培养基的T-25培养瓶中或含有14ml培养基的T-75培养瓶中培养。
3）人胚肾上皮包装细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，先要消化处理并进行细胞计数。消化方法按照细胞传代方法的1-3步骤进行，最后的重悬液使用血清。悬浮细胞直接计数后离心，用血清重悬浮，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中。
三、应用
人胚肾上皮包装细胞可以用于NF-κB转录因子报告基因系统的构建优化及在筛选促TRAIL抗肿瘤药物中的应用：
从抑制TRAIL激活的促存活信号通路NF-κB角度着手,尝试增强TRAIL抗肿瘤的活性。
分为以下四个部分：
1)NF-κB转录因子报告基因系统的构建及优化;
2)利用该系统筛选能下调NF-κB表达量或抑制NF-κB活性的中药成分;
3)将2)中筛选出的中药成分与TRAIL联用,检测其对A549、COLO205等肿瘤细胞的杀伤效果;
4)对3)中中药成分促进TRAIL抗肿瘤活性机制进行初步探索。
研究方法与结果：
1、稳定表达NF-κB转录因子荧光素酶报告基因系统的构建及验证。
利用分子克隆的酶切、连接等基本操作,先将逆转录病毒载体pQCXIP原有的CMV启动子去除,再分别插入NF-κB增强子序列以及荧光素酶NanoLuc(NLuc)报告基因序列,构建了受转录因子NF-κB调控的荧光素酶NLuc报告基因表达载体pQCXIP-NF-κB-NLuc。将构建的pQCXIP-NF-κB-NLuc质粒与病毒包装质粒pVSVG一起用阳离子脂质体法转染人胚肾上皮包装细胞GP2-293细胞系制备相应的逆转录病毒,侵染人宫颈癌细胞系HeLa,通过嘌呤霉素筛选出表达相应抗性基因的阳性细胞,并进一步筛选出对NF-κB通路阳性刺激物TNFα最敏感的细胞克隆。该细胞株对TNFα的刺激呈现出浓度梯度、时间依赖性,表明受NF-κB转录因子调控的稳定表达NLuc荧光素酶的细胞系PP-NF-κB-NLuc-HeLa构建成功,可用于定量检测NF-κB的活化效果及筛选与NF-κB活化调控相关的药物等。
2、优化构建的荧光素酶报告基因系统检测方式。
在上述构建好的荧光素酶报告基因系统的应用过程中发现培养基的pH、培养基中的血清对NLuc荧光素酶的检测有影响,对于后续药物调控功能的检测存在不利影响,因此在初步确定了pH及血清的原因后,选取了NLuc荧光素酶发光强度较强及相对稳定的添加0.03%(V/V)Triton X-100的PBS缓冲液(PBST)作为Nluc酶的检测体系。
3、筛选下调NF-κB的中药成分。在成功完成了系统的构建及NLuc荧光素酶的检测体系优化后,利用该系统对36种中药粗提物或单体进行了检测,并初步筛选出了12种能降低NF-κB活性或下调NF-κB表达量的中药粗提物或单体,在排除了有强细胞毒性的、有相关与TRAIL联用抗肿瘤报道的、促肿瘤增殖的成分等之后,最终选取了QD6-4、SKN两种中药单体进一步研究其与TRAIL的联用的效果。
4、筛选到的中药单体与TRAIL联用对肿瘤的杀伤检测。细胞活力检测实验结果表明,两种单体分别与TRAIL联用作用于人肺癌细胞系A549及结直肠癌细胞系COLO205细胞后,QD6-4对这两个细胞系几乎无任何促进TRAIL抗肿瘤活性的作用,SKN对COLO205几乎无作用,但能显著增强TRAIL对A549的杀伤,且在SKN使用浓度为2-8μM时有协同效果。进一步的实验结果表明,SKN对人结直肠癌细胞系HCT116、人宫颈癌细胞系HeLa、人胰腺癌细胞系PANC-1细胞系也均表现出了促进TRAIL杀伤的效果,其中在使用浓度为2-8μM时对HeLa和PANC-1细胞的杀伤作用均表现出了协同效果,且对PANC-1细胞系的协同效果尤为明显。
北京百欧博伟生物技术有限公司的微生物菌种查询网提供微生物菌种保藏、测序、购买等服务,是中国微生物菌种保藏中心的服务平台，并且是集微生物菌种、菌种,ATCC菌种、细胞、培养基为一体的大型微生物查询类网站，自设设备及技术的微生物菌种保藏中心！欢迎广大客户来询！