一、背景
TSCCA人舌鳞癌贴壁细胞系是由湖北医科大学口腔医学院建立，细胞常规培养在RPMI＋15％小牛血清的培养液中。TSCCa细胞系是被HELA污染的细胞系。
二、TSCCA人舌鳞癌贴壁细胞系培养操作
1）复苏TSCCA人舌鳞癌贴壁细胞系细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）TSCCA人舌鳞癌贴壁细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3）TSCCA人舌鳞癌贴壁细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。
下面T25瓶为类；
1.细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。
3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
三、应用
TSCCA人舌鳞癌贴壁细胞系可以用于转染IL-18基因联合二萜生物碱对舌鳞癌细胞Tscca的增殖抑制与促凋亡作用：
构建白介素-18(IL-18)真核表达载体,通过转染技术将IL-18基因转染入TSCCA人舌鳞癌贴壁细胞系,同时分别加入不同浓度的二萜生物碱(DA),分别采用流式细胞术、MTT实验检测细胞凋亡与增殖抑制情况,最后通过检测Akt/p-Akt通路探究IL-18联合二萜生物碱对TSCCA人舌鳞癌贴壁细胞系可能凋亡机制。
方法：
1、根据Gen Bank中IL-18 DNA序列,设计并合成IL-18基因特异性引物;
2、提取人新鲜血液中单个核淋巴细胞(PBMC),提PBMC的总RNA,RT-PCR方法获得其c DNA,PCR扩增目的片段,构建PEGFPN3-IL-18真核表达质粒,经酶切和测序均鉴定正确后瞬时转染TSCCA人舌鳞癌贴壁细胞系细胞,荧光显微镜下观察质粒的转染效率;
3、DMSO溶解二萜生物碱,调整其浓度为0.2 mg/ml、0.4 mg/ml、0.6 mg/ml;4、MTT法及流式细胞术检测空白对照组(未处理Tscca细胞)、IL-18组(仅转染IL-18)、单独二萜生物碱组(分为0.2 mg/ml、0.4 mg/ml、0.6 mg/ml 3组)及联合组(分为IL-18+0.2 mg/ml、IL-18+0.4 mg/ml、IL-18+0.6 mg/ml 3组)对TSCCA人舌鳞癌贴壁细胞系生长的影响与细胞凋亡情况;5、Western blot实验检测各组细胞信号调节激酶Akt/p-Akt的蛋白水平,分析IL-18联合二萜生物碱是否在此条通路发挥一定作用从而抑制TSCCA人舌鳞癌贴壁细胞系的增殖。
结果：
1、成功构建PEGFPN3-IL-18真核表达质粒;
2、成功转染舌鳞癌细胞,且荧光镜下观察转染PEGFPN3-IL-18真核表达质粒的TSCCA人舌鳞癌贴壁细胞系细胞较未转染细胞凋亡增加;
3、二萜生物碱浓度为0.2、0.4、0.6 mg/ml时,随浓度增大TSCCA人舌鳞癌贴壁细胞系细胞凋亡增多,且均有p<0.05,差异有统计学意义;
4、IL-18与二萜生物碱联合对Tscca细胞作用48 h后,较单独使用二萜生物碱抑制作用明显,且呈浓度依赖性,均有p<0.05,差异有统计学意义;5、IL-18联合二萜生物碱还可剂量依赖性地降低p-Akt的蛋白水平,各组均有p<0.05,差异有统计学意义,而总Akt水平几乎不变。
结论：
1、二萜生物碱对TSCCA人舌鳞癌贴壁细胞系细胞有增殖抑制及促凋亡作用,且呈浓度依赖性;
2、IL-18联合二萜生物碱对TSCCA人舌鳞癌贴壁细胞系有协同抑制作用,且抑制作用较单独使用IL-18或二萜生物碱均较强;
3、IL-18联合二萜生物碱在抑制p-Akt的表达及活化这条信号通路上发挥一定作用从而抑制TSCCA人舌鳞癌贴壁细胞系的增殖并促进其凋亡。
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