首页 > 研究动态 > 细胞迁移的背景与应用及实验方法!
细胞迁移的背景与应用及实验方法!
小杨 / 2023-01-28


一、背景

细胞迁移指即细胞划痕法,是测定细胞迁移运动与修复能力的方法,类似体外伤口愈合模型。在体外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上,用微量枪头或其他硬物在细胞生长的中央区域划线,去除中央部分的细胞,然后继续培养细胞至实验设定的时间,取出细胞培养板,观察周边细胞是否生长至中央划痕区,以此判断细胞的生长迁移能力,实验通常需设定正常对照组和实验组,实验组是加了某种处理因素或药物、外源性基因等组别,通过不同分组之间的细胞对于划痕区的修复能力,可以判断各组细胞的迁移与修复能力。

当细胞长到融合成单层状态时,在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域,称为“划痕”。划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。

二、实验方法

1、培养板接种细胞之前先用marker笔在12孔板背面画横线标记(方便拍照时定位同一个视野)。

2、细胞消化后接入12孔板,数量以贴壁后铺满板底为宜(数量少时可培养一段时间至铺满板底)。

3、细胞铺满板底后,用1ml枪头垂直于孔板制造细胞划痕,尽量保证各个划痕宽度一致。(人工枪头制造划痕难以保证划痕宽度的一致性,影响实验结果,这也是该方法最大的缺陷)。

4、吸去细胞培养液,用PBS冲洗孔板三次,洗去划痕产生的细胞碎片。

5、加入无血清培养基,拍照记录。

6、将培养板放入培养箱培养,每隔4-6小时取出拍照。

7、根据收集图片数据分析实验结果。

三、应用

细胞迁移可以用于NFIC1抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭的分子机制的研究:

探究了NFIC1对Luminal A型和三阴型乳腺癌转移的影响和相关机制。本研究将NFIC1的过表达质粒和si RNA分别转染入MCF7和MDA-MB-231细胞中,Wound healing和Transwell实验结果显示,过表达NFIC1能明显抑制MCF7和MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭;敲低NFIC1能显著促进MCF7和MDA-MB-231细胞的迁移能力和对Matrigel胶的侵袭能力。

为了探究NFIC1抑制迁移和侵袭的分子机制,我们在MCF7和MDA-MB-231细胞中分别瞬时过表达NFIC1后,对NFIC1过表达及其对照细胞进行了RNA测序。对MCF7细胞测序结果的分析发现,对照组与过表达NFIC1组差异基因主要富集在由干扰素介导的Jak-STAT通路上。

随后,我们证实了过表达NFIC1能促进IFNL1、IFNL2/3和IFNB1的表达和分泌,同时也能激活Jak-STAT通路。接下来,我们在过表达NFIC1后使用Jak-STAT通路抑制剂Filgotinib和Ruxolitinib来阻断Jak-STAT通路,发现阻断Jak-STAT通路能逆转NFIC1抑制MCF7细胞迁移和侵袭的效果。

进一步根据测序结果,在过表达NFIC1的细胞中分别敲低Jak-STAT通路的下游靶基因MX1、MX2和RARRES3,发现敲低MX1和MX2能减弱NFIC1过表达对迁移和侵袭的抑制作用。最后,我们在过表达NFIC1同时分别敲低IFNL1、IFNL2/3和IFNB1,此时Jak-STAT通路受到明显抑制、MX1和MX2的表达显著降低、并且NFIC1抑制迁移和侵袭的作用也遭到削弱。

以上结果表明NFIC1在MCF7细胞中通过促进IFNL1、IFNL2、IFNL3和IFNB1的表达激活了Jak-STAT通路,活化的Jak-STAT通路通过上调MX1和MX2的表达来抑制MCF7细胞的迁移和侵袭。通过对MDA-MB-231细胞测序结果中差异表达基因的筛选及验证,我们发现NFIC1能直接结合在S100A2启动子区域从而上调S100A2的表达。

敲低S100A2能逆转NFIC1对MDA-MB-231细胞迁移和侵袭的抑制效果。随后我们发现过表达NFIC1后MEK和ERK的磷酸化水平受到明显的抑制,敲低S100A2能逆转NFIC1对MEK/ERK通路的抑制状态。进一步,在MDA-MB-231细胞中过表达NFIC1同时敲低S100A2后,使用U0126抑制MEK/ERK通路能解除敲低S100A2对迁移和侵袭的逆转效果。

同时,过表达NFIC1上调S100A2后能通过抑制MEK/ERK通路来抑制MDA-MB-231细胞的上皮间充质转化。以上结果表明NFIC1在MDA-MB-231细胞中通过上调S100A2的表达来抑制MEK/ERK通路,进而诱导MDA-MB-231细胞由间充质形态转化为上皮形态,最终抑制MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭。

北京百欧博伟生物技术有限公司的微生物菌种查询网提供微生物菌种保藏、测序、购买等服务,是中国微生物菌种保藏中心的服务平台,并且是集微生物菌种、菌种,ATCC菌种、细胞、培养基为一体的大型微生物查询类网站,自设设备及技术的微生物菌种保藏中心!欢迎广大客户来询!

  • 下载附件
  • 上一篇:大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞的背景与应用!
  • 下一篇:桔青霉的保藏条件与注意事项及打管说明!