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大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞的背景与应用!
小杨 / 2023-01-19


一、背景

大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞采用胰蛋白酶-胶原酶混合灌注消化法结合差速贴壁法,并通过上皮细胞专用培养基培养筛选制备而来,细胞总量约为5×10^5cells/瓶;细胞经SP-C免疫荧光鉴定,纯度可达90%以上,且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞分离自肺组织;肺泡由单层上皮细胞构成的半球状囊泡。肺中的支气管经多次反复分枝成无数细支气管,它们的末端膨大成囊,囊的四周有很多突出的小囊泡,即为肺泡。

小肺泡细胞,又称I型肺泡细胞,厚约0.1微米,基底部是基底膜,无增殖能力。大肺泡细胞,又称Ⅱ型肺泡细胞,分泌表面活性物质(二棕榈酰卵磷脂),以降低肺泡表面张力。Ⅱ型肺泡细胞位于Ⅰ型肺泡细胞之间,数量较Ⅰ型肺泡细胞多,但覆盖面积比Ⅰ型肺泡细胞小。细胞立方形或圆形,顶端突入肺泡腔。细胞核圆形,胞质着色浅、呈泡沫状。电镜下,细胞游离而有少量微绒毛,胞质内富含线粒体和溶酶体,有较发达的粗面内质网和高尔基复合体。

核上方有较多的分泌颗粒,电子密度高、大小不等,直径约0.1-1.0μm颗粒内含有平行排列的板层状结构,称为嗜饿性板层小体。小体内的主要成分为磷脂,以二棕榈酰卵磷脂为主,此外还有糖胺多糖及蛋白质等。颗粒内物质释放出来后,在肺泡表面形成一层粘液层,称为表面活性物质(surfactant)。表面活性物质有降低肺泡表面张力、稳定肺泡大小的作用。

呼气时肺泡缩小,表面活性物质密度增加,表面张力降低,防止肺泡过度塌陷;吸气时肺泡扩张,表面活性物质密度减小,肺泡回缩力加大,可防止肺泡过度膨胀。表面活性物质的缺乏或变性均可引起肺不张,过度通气可造成表面活性物质缺乏;吸入毒气可直接破坏表面活性物质。Ⅱ型肺泡细胞有分裂、增殖并分化为Ⅰ型肺泡细胞的潜能,故具有修复受损伤上皮的作用。

二、应用

大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞用于NLRP3在烟草提取物诱导的大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡中的作用机制研究:

探讨NLRP3在CSE诱导的大鼠II型肺泡上皮细胞(RLE-6TNs)凋亡中的作用机制。

方法:

1、采用不同浓度CSE处理RLE-6TNs 24小时(hour,h)后,采用免疫印迹(western blot)技术检测凋亡执行蛋白Cleaved caspase-3的表达情况;再选取最佳浓度CSE,分别处理RLE-6TNs 0h,12h,24h,48h,使用western blot技术检测Cleaved caspase-3的表达情况。

2、将RLE-6TNs分为空白对照组和2%CSE组,采用定量逆转录聚合酶链式反应(Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,q RT-PCR)和western blot技术检测NLRP3在转录及蛋白水平的表达情况;使用荧光显微镜观察CSE对细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平的影响。

3、将细胞分为2%CSE组,不同浓度MCC950预处理组,western blot技术检测MCC950对CSE上调的NLRP3的影响;在空白对照组,2%CSE组,2%CSE+MCC950组三组细胞中,使用western blot技术检测MCC950对CSE上调的Cleaved caspase-3的影响;采用流氏细胞术检测MCC950对CSE诱导的细胞凋亡的影响。

4、用乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine,NAC)预处理2h后,加入2%CSE再处理24h,使用荧光显微镜观察NAC对CSE上调的胞内ROS水平的影响;western blot方法检测NAC对CSE上调的NLRP3、Cleaved caspase-3的影响。

结果:

1、Western blot检测结果显示:CSE处理后的RLE-6TN细胞内凋亡蛋白Cleaved caspase-3的表达升高,且其表达随着烟草提取物浓度的升高而升高,以2%CSE最为显著;Cleaved caspase-3的表达量随着CSE处理时间的延长而升高,以24h最为明显。

2、Western blot及q RT-PCR检测结果显示:2%CSE在转录及蛋白水平促进细胞内NLRP3的表达;荧光显微镜结果显示:2%CSE提高胞内ROS水平。

3、Western blot检测结果显示:与2%CSE组相比,不同浓度的MCC950都能降低CSE诱导升高的NLRP3的表达,且当浓度为10μM时效应最明显;MCC950降低CSE诱导升高的Cleaved caspase-3的表达;流氏细胞术检测结果显示:MCC950能降低CSE诱导的细胞凋亡率。

4、荧光显微镜结果显示:NAC降低CSE诱导升高的胞内ROS水平;Western blot检测结果显示:NAC降低CSE诱导升高的NLRP3、Cleaved-caspase 3的表达。

结论:

1、CSE以浓度及时间依赖性的方式诱导RLE-6TNs凋亡。

2、ROS/NLRP3通路参与了CSE诱导的RLE-6TNs凋亡。

3、抑制ROS/NLRP3信号通路能部分逆转CSE诱导的RLE-6TNs凋亡。

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