一、背景
小鼠肝窦内皮细胞分离自肝脏组织，是用混合酶灌流消化、反复低速离心、密度梯度离心法，并通过内皮细胞专用培养基培养筛选制备而来。
肝脏是身体内以代谢功能为主的一个器官，并在身体里面起着去氧化、储存肝糖、分泌性蛋白质的合成等作用；肝脏也制造消化系统中之胆汁。肝脏是机体内脏里最大的器官，位于机体中的腹部位置，在右侧横隔膜之下，位于胆囊之前端且于右边肾脏的前方，胃的上方。肝脏是机体消化系统中最大的消化腺，为一红棕色的V字形器官。肝脏是尿素合成的主要器官，又是新陈代谢的重要器官。
肝脏在机体位置和形态结构：肝脏位于右上腹，隐藏在右侧膈下和肋骨深面，大部分肝为肋弓所复盖，仅在腹上区、右肋弓间露出并直接接触腹前壁，肝上面则与膈及腹前壁相接。肝窦内皮细胞(SEC)是肝脏内所占比例最高的非实质细胞，位于肝窦腔与肝细胞之间，具有物质转运、吞噬、抗原提呈、免疫耐受等功能。SEC由于拥有一般细胞所没有的窗孔结构、细胞间连结松散、内皮下缺少基底膜而使其具有高度通透性，从而达到快速交换各种大小分子的目的。
肝在遭到多种病原侵袭时，肝窦内皮细胞窗孔逐渐减少或消失，内皮下基膜形成，产生类似于连续型毛细血管的结构，这一过程称为肝窦毛细血管化。它由多种因素引起，其过程极复杂，在多种肝病的发病前期阶段均有出现，近年来受到广泛关注。
二、应用
用于DLL4高表达促进肝窦内皮细胞毛细血管化及肝纤维化进展研究：
探讨DLL4在肝窦内皮细胞毛细血管化中的作用,及其在肝纤维化发生、进展中的角色。进一步揭示肝纤维化的发病机制,为肝纤维化的治疗提供新思路。
方法：应用免疫组织化学及免疫荧光技术判断HBV所致人肝硬化组织及CCl4诱导的小鼠肝纤维化组织DLL4的表达及分布。利用免疫组织化学技术动态观察CCl4诱导的肝纤维化小鼠肝窦内皮细胞毛细血管化的标志分子CD31、v WF的表达,应用扫描电镜动态观察肝窦内皮细胞窗孔的变化,透射电镜动态观察肝窦内皮下细胞基底膜的形成。RT-PCR和Western blot检测肝窦内皮细胞DLL4的表达,Notch信号通路的激活情况及细胞基底膜组份Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白,层黏连蛋白,纤黏连蛋白的表达。
构建DLL4过表达和敲减的人肝窦内皮细胞（TMNK-1）慢病毒稳定转染细胞株,RNA-sequence分析DLL4过表达引起肝窦内皮细胞毛细血管化的机制。利用Transwell实验及人肝窦内皮细胞与星状细胞的共培养探索DLL4对肝内血管阻力的影响。低氧培养明确低氧诱导因子-1α是否能诱导肝窦内皮细胞DLL4的表达。最后构建针对小鼠DLL4的si RNA,通过尾静脉注射观察其对CCl4造模小鼠肝窦内皮细胞毛细血管化的缓解及肝纤维化的治疗作用。
结果：DLL4在HBV相关人肝硬化组织及CCl4诱导小鼠肝纤维化组织中表达明显升高,主要位于肝窦内皮细胞。伴随DLL4表达升高,CCl4诱导肝纤维化小鼠肝窦内皮细胞CD31、v WF的表达也明显升高,窗孔逐渐减少,内皮下细胞基底膜逐渐形成。与对照组相比,4w及6w CCl4小鼠肝窦内皮细胞DLL4、CD31v WF的表达升高,Notch信号通路激活,细胞基底膜组份I、III、IV型胶原蛋白,层黏连蛋白,纤黏连蛋白的表达升高。
GO及pathway分析证明DLL4可诱导肝窦内皮细胞分泌细胞基底膜组份蛋白。DLL4表达升高损害了肝窦内皮细胞e NOS-s GC信号,促进endothelin-1的表达,并且增加星状细胞对肝窦内细胞的覆盖,最终导致肝窦阻力增高。在肝纤维化进程中,低氧诱导因子-1α可诱导肝窦内皮细胞DLL4的表达。尾静脉注射DLL4-si RNA可以缓解CCl4造模小鼠的肝窦内皮细胞毛细血管化与肝纤维化。结论:DLL4介导的Notch信号可促进肝窦内皮细胞的毛细血管化。DLL4在肝纤维化肝脏血管病理性改建中发挥重要作用。
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