百欧博伟带您了解ATCC菌种肉毒梭菌及肉毒毒素是怎样检验的？
中国微生物菌种查询网 / 2018-09-03 16:17:38
百欧博伟带您了解ATCC菌种肉毒梭菌及肉毒毒素是怎样检验的？
一、设备和材料
1 冰箱：0℃-4℃。
2 恒温培养箱士 30℃±1、35℃±1、36℃±1.
3 离心机：3 000r/min.
4 显微镜：10×?100×，
5 相差显微镜。
6 均质器或灭菌乳鉢。
7 架盘药物天平：0g?500g，精确至0.5g
8 厌氧培养装罝：常温催化除氧式或碱性焦性没石子酸除氧式。
9 灭菌吸管：1ml(具0.01ml刻度〕、10ml(具0.1ml刻度〕。
10 灭菌平皿：直径90mm.
11 灭菌锥形瓶500ml.
12 灭菌注射器1ml.
13 小白鼠：12g?15g。
二、培养基和试剂
1 庖肉培养基GB/T 4789.28—2003中 4.67。
2 卵黄琼腊培养基GB/T 4789，28-2003中4.68。
3 明胶磷酸盐缓冲液GB/T 4789.28—2003中3.23。
4 肉毒分型抗毒诊断血清。
5 胰酶：活力1 : 250。
6 革兰氏染色液：GB/T 4789.28—2003 中 2.2.
三、操作步驟
1 肉毒毒素检测
液状检样可直接离心，固体或半流动检样须加适量(例如等量、倍量或5倍量、10倍量）明胶磷酸盐缓冲液，浸泡、研碎，然后离心，取上清液进行检测。另取一部分上清液,调PH6.2，每9份加10%胰酶(活力1：250〉水溶液1份,混匀，不断轻轻搅动，37℃作用60min，进行检测。
2 肉毒毒素检测以小白鼠腹腔注射法为标准方法。
检出试验：取上述离心上清液及其胰酶激活处理液分别注射小白鼠三只，每只0.5ml，观察4d注射液中若有肉毒毒素存在，小白鼠一般多在注射后24h内发病、死亡。主要症状为竖毛、四肢瘫软，呼吸困难，呼吸呈风箱式,腰部凹陷，宛若蜂腰，最终死于呼吸麻痹。如遇小鼠猝死以至症状不明显时，则可将注射液做适当稀释，重做试验。
确证试验:不论上清液或其胰酶激活处理液,凡能致小鼠发病、死亡者，取样分成三份进行试验，—份加等量多型混合肉毒抗毒诊断血清,混匀，37℃作用30min，一份加等量明胶磷酸盐缓冲液,混匀，煮沸10min,一份加等量明胶磷酸盐缓冲液，混匀即可,不做其他处理。三份混合液分别注射小白鼠各两只,每只0.5ml观察4d若注射加诊断血淸与煮沸加热的两份混合液的小白鼠均获保护存活，而唯有注射未经其他处理的混合液的小白鼠以特有的症状死亡,则3 可判定检样中的肉毒毒素存在,必要时要进行毒力测定及定型试验。
毒力测定:取已判定含有肉毒毒素的检样离心上清液，用明胶磷酸盐缓冲液做成50倍、500倍及5 000倍的稀释液，分别注射小白鼠各两只，每只0.5ml，观察4d根据动物死亡情况,计算检样所含肉毒毒素的大体毒力（MLD/ml或MLD/g）例如：5倍、50倍及500倍稀释致动物全部死亡，而注射5 000倍稀释液的动物全部存活，则可大体判定检样上清液所含毒素的毒力为1 000MLD/ml?10 000 MLD/ml.
4 定型试验:按毒力测定结果，用明胶磷酸盐缓冲液将检样上清液稀释至所含毒素的毒力大体在10MLD/ml~1 000 MLD/ml的范围，分别与各单型肉毒抗诊断血清等量混匀，37℃作用30min，各注射小鼠两只，每只0.5 ml，观察4d同时以明胶磷酸盐缓冲液代替诊断血清,与稀释毒素液等量混合作为对照。能保护动物免于发病、死亡的诊断血清型即为检样所含肉毒毒素的型别。
四、肉毒梭菌及肉毒毒素检验程（见下图）
肉毒梭菌属于厌氧性梭状芽胞杆菌属，具有该菌的基本特性，即厌氧性的杆状菌，形成芽胞，芽胞比繁殖体宽，呈梭状，新鲜培养基的革兰氏染色为阳性，产生剧烈细菌外毒素，即肉毒毒素。 肉毒梭菌生长时，可形成一种强力的毒素抑制呼吸导致死亡，这是迄今为止所知的最毒的自然生成的毒素之一。 而肉毒毒素（botulinum toxin，AX）是肉毒杆菌产生的含有高分子蛋白的神经毒素，是目前已知在天然毒素和合成毒剂中毒性最强烈的生物毒素，它主要抑制神经末梢释放乙酰胆碱，引起肌肉松弛麻痹，特别是呼吸肌麻痹是致死的主要原因。