志贺氏菌在生化鉴定和血清学鉴定中的注意事项有哪些？
小杨 / 2026-03-05 09:20:03
志贺氏菌的生化鉴定和血清学鉴定是确证菌种的核心步骤，操作中需严格把控纯培养质量、反应条件、结果判读等关键环节，以下是两类鉴定的详细注意事项：
一、生化鉴定的注意事项
1、纯培养是鉴定的前提
必须从选择性培养基（XLD、SS 琼脂）挑取疑似菌落，在营养琼脂平板上纯化培养 1~2 代，确保菌落形态均一、无杂菌污染。
禁止直接用选择性培养基上的菌落进行生化试验，避免培养基中胆盐、指示剂等成分干扰酶活性和发酵反应。
2、菌悬液浓度标准化
接种生化管或自动化鉴定卡时，菌悬液浓度需匹配要求（常规为 0.5~1.0 麦氏浊度）。浓度过高会导致发酵底物快速耗尽，出现假阳性；浓度过低则反应微弱，难以判读。
挑取菌落时需避免带入琼脂碎片，防止碎片中的营养成分影响结果。
3、严格控制培养条件
培养温度需稳定在 36±1℃，温度过高会破坏菌株酶系统，温度过低则发酵反应延迟。
培养时间严格遵循 18~24h：葡萄糖发酵、乳糖发酵等试验不可超过 24h，否则宋内氏志贺氏菌可能出现延迟发酵乳糖的假阳性；动力试验需培养 24~48h，确保结果稳定。
4、关键试验的结果判读要点
赖氨酸脱羧酶试验：需覆盖液体石蜡隔绝空气，否则易出现假阴性；志贺氏菌为阴性，若出现阳性可直接排除。
硫化氢试验：以 TSI 琼脂底层无黑色沉淀为阴性判定标准，避免因培养基中含铁离子杂质导致的假阳性。
动力试验：半固体培养基穿刺接种时，需保持穿刺线笔直，仅观察穿刺线周围是否有扩散生长，志贺氏菌无动力，若出现扩散需重新纯化菌株。
5、自动化鉴定的特殊要求
使用 VITEK 2、MicroScan 等系统时，需严格按照仪器说明书制备菌悬液，确保浊度符合卡板要求。
若自动化鉴定结果置信度＜90%，需结合常规生化试验进行复核，不可直接报告结果。
二、血清学鉴定的注意事项
1、诊断血清的质量控制
血清需在2~8℃避光保存，禁止反复冻融，否则会导致抗体效价下降或变性。
过期血清或出现浑浊、沉淀的血清严禁使用。
2、菌悬液的制备要点
挑取纯培养菌落，用0.85% 无菌生理盐水制备菌悬液，浓度为 1.0 麦氏浊度（肉眼观察呈轻度浑浊），避免用自来水或缓冲液，防止离子强度影响抗原抗体结合。
若菌悬液出现自凝（加生理盐水也凝集），需用生理盐水反复洗涤菌体 3 次，重新制备悬液；自凝严重的菌株需结合生化特征综合判定，不可仅凭血清学结果排除。
3、凝集试验的操作规范
载玻片需洁净无油污，划分的试验区和阴性对照区需清晰分离，避免交叉污染。
血清与菌悬液的比例为 1:1，用接种环充分混匀，轻轻晃动载玻片，室温下观察 1~2min，不可超过 5min，否则水分蒸发易出现假阳性凝集。
判定标准：出现肉眼可见的颗粒状凝集为阳性；仅出现均匀浑浊或轻微絮状沉淀为阴性。
4、分型鉴定的流程把控
先使用4 种群特异性血清（A 群痢疾、B 群福氏、C 群鲍氏、D 群宋内氏）进行初筛，确定血清群后，再用该群的型特异性血清进行分型，不可颠倒顺序。
宋内氏志贺氏菌存在S-R 变异，粗糙型（R 型）菌株 O 抗原缺失，可能不与血清凝集，需结合生化特征（如迟缓发酵乳糖、动力阴性）确认。
5、排除非特异性凝集的干扰
若菌株与多种群血清凝集，可能是存在共同抗原，需用吸收试验去除交叉抗体后再鉴定。
试验环境温度需控制在 20~25℃，温度过低会减慢凝集反应速度，温度过高可能导致抗原变性。
三、两类鉴定的共性注意事项
1、生物安全防护
志贺氏菌属于乙类致病菌，所有操作需在BSL-2 实验室进行，操作人员需穿戴防护服、手套、口罩。
实验废弃物（包括生化管、载玻片、菌悬液）需经 121℃高压灭菌 30min 后再处理，严禁随意丢弃。
2、对照试验的设置
生化鉴定需设置阳性对照（对应标准菌株）和阴性对照（无菌生理盐水），确保培养基和试剂有效性。
血清学鉴定必须设置生理盐水阴性对照，排除菌悬液自凝的干扰。
3、结果的综合判定
当生化特征符合志贺氏菌，但血清学凝集阴性时，不可直接排除，需考虑菌株抗原变异、血清效价不足等因素，可更换不同厂家血清重试。
当血清学凝集阳性，但生化特征不符时，需重新纯化菌株，排除杂菌污染导致的假阳性。
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