大鼠肾小球系膜细胞原代培养与鉴定的注意事项有哪些？
小杨 / 2026-03-03 10:02:14
大鼠肾小球系膜细胞常用于肾病发生机理的临床研究，也可用于构建动物摸型。肾小球系膜是位于肾小球毛细血管襻中轴中心部位的一种特殊间充质组织，由间充质细胞和充填于其间的系膜基质所组成。
一、取材与肾小球分离（最关键）
1、鼠龄一定要合适
推荐：4～6 周，100～150 g SD 大鼠
太小：肾小球少；太大：纤维化多、难消化、难长。
2、只取肾皮质，坚决去髓质
髓质里小管、内皮细胞巨多，会严重污染。
3、研磨力度要轻
轻磨到乳白色混悬液即可，不要磨成泥。
磨太狠 → 肾小球破碎 → 不出细胞。
4、筛网顺序不能乱
先 80 目去大块 → 再 200 目留肾小球
200 目筛上的才是你要的。
5、全程冰上操作
离体肾、分离肾小球都要低温，减少酶自溶。
二、消化（决定细胞死活）
1、胶原酶浓度不要太高
常用 0.8～1 mg/mL Ⅰ 型胶原酶
浓度太高 → 消化过度 → 细胞不贴壁、全死。
2、消化时间严格控制
37 ℃ 20～30 min，不要超过 35 min。
中途轻晃 2～3 次即可。
3、必须用血清彻底终止消化
消化不完 → 细胞聚团、难贴壁
消化过头 → 细胞碎片多、不生长
三、培养与换液（决定纯度）
1、首次换液一定要晚
48 h 再第一次换液
换太早：刚贴壁的系膜细胞被一起倒掉。
2、差速贴壁是纯化核心
传代时：消化后先贴壁 30～40 min
先贴壁的 = 系膜细胞
3、不贴壁的上清弃掉（多为内皮、足细胞）
重复 1～2 次，纯度直接 >90%。
4、不要用太高代细胞
推荐：P2～P4
P5 以后容易表型转化、α‑SMA 变弱。
5、避免反复过度胰酶消化
镜下看到细胞回缩、变圆就立刻终止
消化久 → 细胞膜损伤 → 状态越来越差
四、细胞鉴定（别做无用功）
1、必须做双标：阳性 + 阴性
阳性：α‑SMA、Desmin
阴性：CD31/Ⅷ 因子（内皮）、Podocin（足细胞）
只染一个阳性不算鉴定。
不要用原代太早做鉴定
2、P0 杂细胞多
推荐 P1 或 P2 鉴定最准确。
形态只能辅助，不能当证据
梭形、漩涡状生长 → 像系膜细胞
最终以免疫荧光/ ICC为准。
五、最常见失败原因（提前避开）
不出细胞：肾小球破碎、消化过度、鼠龄太大
不贴壁：胰酶损伤、血清差、肾小球数量太少
杂细胞爆炸多：没去髓质、没过筛干净、没差速贴壁
污染：取肾无菌不严、筛网/器械消毒不彻底
越养越差：代次太高、反复过度消化
六、极简总结（记住这几句就够）
鼠龄适中，只取皮质，轻研磨。
先 80 目后 200 目，留肾小球。
胶原酶温和消化，20–30 min。
48 h 首换液，差速贴壁提纯。
P2–P4 做实验，α‑SMA+CD31/Podocin 鉴定。
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