常规两步法制备枯草芽孢杆菌感受态细胞及转化方法
中国微生物菌种查询网 / 2019-01-25 09:56:49

一、枯草杆菌普通化学感受态细胞制备及转化方法:
1)  将枯草芽孢杆菌菌种接种在LB平板上37 ℃培养1-2天,孢子形成率接近100%。
2)  用接种环接一环菌苔于5mL GM I 溶液,在30℃慢摇床(125 r/min)振荡培养过夜。
3)  次日取2 mL转接到18 mL GM I 中,37℃快摇床(250 r/min)培养3.5 h。
4)  再取10 mL上一步骤的培养液转接到90 mL GM II 中,37℃慢摇床培养90 min后,5,000 g,10 min离心收集菌体。
5)  用10 mL原培养液上清液轻轻悬浮菌体,悬浮后的菌体即为感受态细胞可以直接用来转化。
6)  感受态细胞的保存:加30%的灭菌甘油至终浓度为10%,混匀后分装到离心管中(0.5 mL/tube),随即放到-70 ℃保存。
7)  转化时取出离心管,放在45 ℃水浴中溶化,然后在0.5 mL菌液中加入适量DNA(~1 ug/ml)。
8)  于37 ℃振荡(200 r/min)培养30 -120 min后涂于相应抗性平板,再在37 ℃培养过夜,检查并验证转化子。
二、备用试剂:
[1]  10×最低盐溶液:K2HPO4 70 g,KH2PO4 30 g,(NH4)2SO4 10 g,(Na3C6H5O7?2H2O)5 g,MgSO4?7H2O 1 g,在蒸馏水中依次溶解,加水至500 mL。
[2]  氨基酸溶液(根据不同菌株的基因缺陷型准备,如WB600的氨基酸是 L- trp溶液):10 mg/mL,贮于棕色瓶内,113℃灭菌30 min,用黑纸包裹。
[3]  GM I溶液:1×最低盐溶液95.6 mL,20%葡萄糖2.5 mL,5%水解酪蛋白0.4 mL,10%酵母汁(yeast extract)1 mL,10 mg/mL氨基酸溶液0.5 mL(50 μg/mL)。
[4]  GM II溶液:1×最低盐溶液96.98 mL,20%葡萄糖2.5 mL,5%水解酪蛋白0.08 mL,10%酵母汁(yeast extract)0.04 mL,1 M MgCl2 0.25 mL(2.5 mM),1 M CaCl2 0.05 mL(0.5 mM),10 mg/mL氨基酸溶液0.1 mL(5 μg/mL)。
       为更好的为广大用户需求单位于2016年8月1日联合第三方鉴定机构和中国微生物菌种保藏中心开展为微生物检验鉴定服务。提交者需提交时告知样品名称、样品提供的形式(单一纯菌种或者斜面菌种)、用途(科研;医药;微生物肥料;微生物饲料;其他)、培养条件等信息。

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