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1 范围
本方法适用于饮料中志贺氏菌的检验。
2 原理
饮料样品处理后，经增菌、分离、生物学实验及血清学鉴定判定志贺氏菌型，报告结果。
3 试剂
3.1 GN增菌液
3.1.1 成分
胰蛋白胨 20g
葡萄糖 1g
甘露醇 2 g
柠檬酸钠 5g
去氧胆酸钠 0.5g
磷酸氢二钾 4 g
磷酸二氢钾 1.5g
氯化钠 5 g
蒸馏水 1000mL
3.1.2 制法
按上述成分配好，加热使溶解，校正pH7.0。分装每瓶225mL，115℃高压灭菌15min。
3.2 HE 琼脂
3.2.1 成分
月示胨 12g
牛肉膏 3g
乳糖 12g
蔗糖 12g
水杨素 2g
胆盐 20g
氯化钠 5g
琼脂 18～20g
蒸馏水 1000mL
0.4％ 溴麝香草酚蓝溶液 16mL
Andrade 指示剂 20mL
甲 液 20mL
乙液 20mL
3.2.2 制法
将前面七种成分溶解于 400mL 蒸馏水内作为基础液，将琼脂加入于 600mL 蒸馏水内，加热溶解。加入甲液和乙液于基础液内，校正 pH7.5。再加入指示剂，并与琼脂液合并，待冷至 50～55℃，倾注平板。
注：①此培养基不可高压灭菌。
②甲液的配制
硫代硫酸钠 34g
柠檬酸铁铵 4g
蒸馏水 100mL
③乙液的配制
去氧胆酸钠 10g
蒸馏水 100mL
④Andrade 指示剂的配制
酸性复红 0.5g
1mol/L 氢氧化钠溶液 16mL
蒸馏水 100mL
将复红溶解于蒸馏水中，加入氢氧化钠溶液。数小时后如复红褪色不全，再加氢氧化钠溶液 1～2mL。
3.3 SS 琼脂
3.3.1 基础培养基
牛肉膏 5g
月示胨 5g
三号胆盐 3.5g
琼脂 17g
蒸馏水 1000mL
将牛肉膏、月示胨和胆盐溶解于400mL蒸馏水中，将琼脂加入于600mL蒸馏水中，煮沸使其溶解，再将两液混合，121℃高压灭菌15min，保存备用。
3.3.2 完全培养基
基础培养基 1000mL
乳糖 10g
柠檬酸钠 8.5g
硫代硫酸钠 8.5g
10％柠檬酸铁溶液 10mL
1％中性红溶液 2.5mL
0.1％煌绿溶液 0.33mL
加热溶化基础培养基 ，按比例加入上述染料以外之各成分，充分混合均匀 ，校正至 pH7.0，加入中性红和煌绿溶液 ，倾注平板。
注；①制好的培养基宜当日使用 ，或保存于冰箱内于 48h 内使用。
②煌绿溶液配好后应在 10d 以内使用。
③可以购用 SS 琼脂的干燥培养基。
3.4 麦康凯琼脂
3.4.1 成分
蛋白胨 17g
月示胨 3g
猪胆盐(或牛、羊胆盐) 5g
氯化钠 5g
琼脂 17g
蒸馏水 1000mL
乳糖 10g
0.1％ 结晶紫水溶液 10mL
0.5％ 中性红水溶液 5mL
3.4.2 制法
将蛋白胨、月示胨、胆盐和氯化钠溶解于 400mL 蒸馏水中，校正 pH7.2。将琼脂加入 600mL 蒸馏水中，加热溶解。将两液合并，分装于烧瓶内，121℃高压灭菌 15min
备用。临用时加热溶化琼脂，趁热加入乳糖，冷至 50～55℃时，加入结晶紫和中性红水溶液，摇匀后倾注平板。
注：结晶紫及中性红水溶液配好后须经高压灭菌。
3.5 伊红美蓝琼脂（EMB）
3.5.1 成分
蛋白胨 10g
乳糖 10g
磷酸氢二钾 2g
琼脂 17g
2％伊红 Y 溶液 20mL
0.65％ 美蓝溶液 10mL
蒸馏水 1000mL
3.5.2 制法
将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正pH7.1，分装于烧瓶内，121℃高压灭菌15min备用。临用时加入乳糖并加热溶化琼脂，冷至50～55℃，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。
3.6 三糖铁琼脂（TSI）
3.6.1 成分
蛋白胨 20g
牛肉膏 5g
乳糖 10g
蔗糖 10g
葡萄糖 1g
氯化钠 5g
硫酸亚铁铵 〔Fe(NH4 )2 (SO4 )2 ?6H2O〕 0.2g
硫代硫酸钠 0.2g
琼脂 12g
酚红 0.025g
蒸馏水 1000mL
3.6.2 制法
将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于水中，校正pH7.4。加入琼脂，加热煮沸，以溶化琼脂。加入0.2%酚红水溶液12.5mL，摇匀。分装试管，装量宜多些，以便得到较高的底层。121℃高压灭菌15min。放置高层斜面备用。
3.7 三糖铁琼脂（换用方法）
3.7.1 成分
蛋白胨 15g
月示胨 5g
牛肉膏 3g
酵母膏 3g
乳糖 10g
蔗糖 10g
葡萄糖 1g
氯化钠 5g
硫酸亚铁 0.2g
硫代硫酸钠 0.3g
琼脂 12g
酚红 0.025g
蒸馏水 1000mL
3.7.2 制法
将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于水中，校正pH7.4。加入琼脂，加热煮沸，以溶化琼脂。加入0.2%酚红水溶液12.5mL，摇匀。分装试管，装量宜多些，以便得到较高的底层。121℃高压灭菌15min。放置高层斜面备用。
3.8 葡萄糖半固体管
3.8.1 成分
蛋白胨 1g
牛肉膏 0.3g
氯化钠 0.5g
葡萄糖 1g
1.6%溴甲酚紫酒精溶液 0.1mL
琼脂 0.3g
蒸馏水 100mL
3.8.2 制法
将蛋白胨、牛肉膏和氯化钠加入于水中，校正pH7.4后加入琼脂加热溶解，再加入指示剂和葡萄糖，分装小试管，灭菌121℃ 15min。
3.9 半固体管
3.9.1 成分
蛋白胨 1g
牛肉膏 0.3g
氯化钠 0.5g
琼脂 0.35～0.4g
蒸馏水 100mL
3.9.2 制法
按以上成分配好，煮沸使溶解，并校正pH7.4。分装小试管。121℃高压灭菌15min。直立凝固备用。
3.10 葡萄糖铵琼脂
3.10.1 成分
氯化钠 5g
硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.2g
磷酸二氢铵 1g
磷酸氢二钾 1g
葡萄糖 2g
琼脂 20g
蒸馏水 1000mL
0.2％溴麝香草酚蓝溶液 40mL
3.10.2 制法
先将盐类和糖溶解于水内，校正 pH6.8，再加琼脂，加热溶化，然后加入指示剂，混合均匀后分装试管，121℃高压灭菌 15min，放成斜面。
3.11 尿素琼脂（pH7.2）
3.11.1 成分
蛋白胨 1g
氯化钠 5g
葡萄糖 1g
磷酸二氢钾 2g
0.4%酚红溶液 3mL
琼脂 20g
蒸馏水 1000mL
20％尿素溶液 100mL
3.11.2 制法
将除尿素和琼脂以外的成分配好，并校正 pH7.2±0.1，加入琼脂，加热溶化并分装烧瓶。121℃高压灭菌 15min。冷至 50～55℃，加入经除菌过滤的尿素溶液。尿素的最终浓度为 2％，最终 pH 应为 7.2±0.1。分装于灭菌试管内，放成斜面备用。
3.11.3 试验方法
挑取琼脂培养物接种，在 36±1℃培养 24h，观察结果。尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色。
3.12 西蒙氏柠檬酸盐琼脂
3.12.1 成分
氯化钠 5g
硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.2g
磷酸二氢铵 lg
磷酸氢二钾 lg
柠檬酸钠 5g
琼脂 20g
蒸馏水 1000mL
0.2％溴麝香草酚蓝溶液 40mL
3.12.2 制法
先将盐类溶解于水内，校正 pH6.8，再加琼脂，加热溶化。然后加入指示剂，混合均匀后分装试管，121℃高压灭菌 15min。放成斜面。
3.13 氰化钾（KCN）培养基
3.13.1 成分
蛋白胨 10g
氯化钠 5g
磷酸二氢钾 0.225g
磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O) 5.64g
蒸馏水 1000mL
0.5％氰化钾溶液 20mL
pH7.6
3.13.2 制法
将除氰化钾以外的成分配好后分装烧瓶，121℃高压灭菌 15min。放在冰箱内使其充分冷却。每 100mL 培养基加入 0.5％氰化钾溶液 2.0mL(最后浓度为 1︰10 000)，分装于 12mm～100mm 灭菌试管，每管约 4mL，立刻用灭菌橡皮塞塞紧，放在 4 C 冰箱内，至少可保存两个月。同时，将不加氰化钾的培养基作为对照培养基，分装试管备用。
注：氰化钾是剧毒药物，使用时应小心，切勿沾染，以免中毒。夏天分装培养基应在冰箱内进行。试验失败的主要原因是封口不严，氰化钾逐渐分解，产生氢氰酸气体逸出，
以致药物浓度降低，细菌生长，因而造成假阳性反应。试验时对每一环节都要特别注意。
3.14 氨基酸脱羧酶试验培养基：赖氨酸、鸟氨酸及对照培养基
3.14.1 成分
蛋白胨 5g
酵母浸膏 3g
葡萄糖 1g
蒸馏水 1000mL
1.6％溴甲酚紫—乙醇溶液 1mL
L-氨基酸或 DL-氨基酸 0.5 或 lg/100mL
3.14.2 制法
除氨基酸以外的成分加热溶解后，分装每瓶 100mL，分别加入各种氨基酸：赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸。L-氨基酸按 0.5％加入，DL-氨基酸按 1％加入。再行校正 pH至 6.8。对照培养基不加氨基酸。分装于灭菌的小试管内，每管 0.5mL，上面滴加一层液体石蜡，115℃高压灭菌 10min。
3.15 糖发酵管：棉子糖、甘露醇、甘油、七叶苷及水杨苷
3.15.1 成分
牛肉膏 5g
蛋白胨 10g
氯化钠 3 g
磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O) 2g
0.2％溴麝香草酚蓝水溶液 12mL
蒸馏水 100mL
pH7.4
3.15.2 制法
葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按 0.5％加入葡萄糖，分装于有一个倒置小管的小试管内， 121℃高压灭菌 15min。
3.15.2.1 其他各种糖发酵管可按上述成分配好后，分装每瓶 100mL，121℃高压灭菌15min。另将各种糖类分别配好 10％溶液，同时高压灭菌。将 5mL 糖溶液加入于 100mL
培养基内，以无菌操作分装小试管。
注：蔗糖不纯，加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。
3.15.2.2 试验方法：从琼脂斜面上挑取小量培养物接种，于36土1℃培养，一般观察2～
3d。迟缓反应需观察14～30d。
3.16 5%乳糖发酵管
3.16.1 成分
蛋白胨 0.2g
氯化钠 0.5g
乳糖 5 g
2％ 溴麝香草酚蓝水溶液 1.2mL
蒸馏水 100mL
3.16.2 制法
除乳糖以外的各成分溶解于 50mL 蒸馏水内，校正 pH7.4。将乳糖溶解于另外 50mL蒸馏水内，分别灭菌 121℃15min，将两液混合，以无菌操作分装于灭菌小试管内。
注：在此培养基内，大部分乳糖迟缓发酵的细菌可于 1d 内发酵。
3.17 蛋白胨水、靛基质试剂
3.17.1 成分
蛋白胨(或胰蛋白胨) 20g
氯化钠 5 g
蒸馏水 1000mL
pH7.4
3.17.2 制法
按上述成分配制，分装小试管，121℃高压灭菌 15min。
3.17.3 靛基质试剂
3.17.3.1 柯凡克试剂：将 5g 对二甲氨基苯甲醛溶解于 75mL 戊醇中。然后缓慢加入浓盐酸 25mL。
3.17.3.2 欧-波试剂：将 l g 对二甲氨基苯甲醛溶解于 95 mL95％乙醇内。然后缓慢加入浓盐酸 20 mL。
注：蛋白胨中应含有丰富的色氨酸。每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。
3.18 志贺氏菌属诊断血清。
4 设备和材料
4.1 天平
4.2 均质器或乳钵
4.3 温箱
4.4 显微镜
4.5 灭菌广口瓶，500 mL
4.6 灭菌三角烧瓶，500 mL、250 mL
4.7 灭菌平皿，90 mm×15 mm
4.8 载玻片
4.9 酒精灯
4.10 灭菌金属匙或玻璃棒
4.11 接种棒，镍铬丝
4.12 试管架、试管篓
4.13 硝酸纤维素滤膜：150 mm×50 mm，Φ0.45 mm。临用时切成两张，每张 70 mm×50 mm，用铅笔划格，每格 6 mm×6 mm。每行 10 格，分 6 行。灭菌备用。
5 操作步骤
5.1 增菌
称取检样 25 g，加入装有 225 mLGN 增菌液的 500 mL 广口瓶内，于 36℃培养 6～8 h。培养时间视细菌生长情况而定，当培养液出现轻微混浊时即应中止培养。
5.2 分离和初步生化试验
5.2.1 取增菌液 1 环，划线接种于 HE 琼脂平板或 SS 琼脂平板 1 个；另取 1 环划线接种于麦康凯琼脂平板或伊红美蓝琼脂平板 1 个，于 36℃培养 18～24 h，志贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。
5.2.2 挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各 1 管。一般应多挑几个菌落，以防遗漏，经 36℃培养 18～24 h，分别观察结果。
5.2.3 下述培养物可以弃去：
a. 在三糖铁琼脂斜面上呈蔓延生长的培养物；
b. 在 18～24 h 内发酵乳糖、蔗糖的培养物；
c. 不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的培养物；
d. 产气的培养物；
e. 有动力的培养物；
f. 产生硫化氢的培养物 ；
5.2.4 凡是乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气（福氏志贺氏菌 6 型可产生少量气体），无动力的菌株，可做血清学分型和进一步的生化试验。
5.3 血清学分型和进一步的生化试验
5.3.1 血清学分型
挑取三糖铁琼脂上的培养物，做玻片凝集试验。先用 4 种志贺氏菌多价血清检查，如果由于 K 抗原的存在而不出现凝集，应将菌液煮沸后再检查；如果呈现凝集，则用 A1、A2、B
群多价和 D 群血清分别试验。如系 B 群福氏志贺氏菌，则用群和型因子血清分别检查。福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原见表 1。可先用群因子血清检查，再根据群因子血清出现凝集的结果，依次选用型因子血清检查。
4 种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株，可用鲍氏多价 1、2、3 分别检查，并进一步用 1～15 各型因子血清检查。如果鲍氏多价血清不凝集，可用痢疾志贺氏菌 3～12 型多价血清及各
型因子血清检查。
型和亚型 型抗原 群抗原 在群因子血清中的凝集
3，4 6 7，8
1a I 1，2，4，5，9…… + － －
1b I 1，2，4，5，9…… + + －
2a Ⅱ 1，3，4…… + － －
2b Ⅱ 1，7，8，9…… － － +
3a Ⅲ 1，6，7，8，9…… － + +
3b Ⅲ 1，3，4，6…… + + －
4a Ⅳ 1，（3，4）…… （+） － －
4b Ⅳ 1，3，4，6…… + + －
5a Ⅴ 1，3，4…… + － －
5b Ⅴ 1，5，7，9…… － － +
6 Ⅵ 1，2，（4） （+） － －
X 变体 — 1，7，8，9…… － － +
Y 变体 — 1，3，4…… + － －
注：+凝集；－不凝集；（+）有或无。
5.3.2 进一步的生化试验
在做血清学分型的同时，应做进一步的生化试验，即：葡萄糖铵，西蒙氏柠檬酸盐，赖
氨酸和鸟氨酸脱羟酶，pH7.2 尿素，KCN 生长，以及水杨苷和七叶苷的分解。除宋内氏菌和
鲍氏 13 型为鸟氨酸阳性外，志贺氏菌属的培养物均为阴性结果。必要时还应做革兰氏染色检
查和氧化酶试验，应为氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌。生化反应不符合的菌株，即使能与某
种志贺氏菌分型血清发生凝集，仍不得判定为志贺氏菌属的培养物。
已判定为志贺氏菌属的培养物，应进一步做 5%乳糖发酵，甘露醇、棉子糖和甘油的发酵
和靛基质试验。志贺氏菌属 4 个生化群的培养物，应符合该群的生化特性。但福氏 6 型的生
化特性与 A 群或 C 群相似，见表 2。
表 2 志贺氏菌属四个群的生化特性
生化群 5%乳糖 甘露醇 棉子糖 甘油 靛基质
A 群：痢疾志贺氏菌 － － － （+） －/+
B 群：福氏志贺氏菌 － + + － （+）
C 群：鲍氏志贺氏菌 － + － （+） －/+
D 群：宋内氏志贺氏菌 +/（+） + + d －
注：+阳性；－阴性；－/+多数阴性，少数阳性；（+）迟缓阳性；d 有不同生化型。
5.4 结果报告：综合生化和血清学的试验结果判定菌型并作出报告。
6 参考文献
GB 4789.5—1994 “食品卫生微生物学检验 志贺氏菌检验”。