1 范围
本方法适用于饮料中金黄色葡萄球菌的检验。
2 原理
饮料样品处理后，经增菌及分离，采用血浆凝固酶试验判定结果并计数。
3 试剂
3.1 胰酪胨大豆肉汤
3.1.1 成分
胰酪胨(或胰蛋白胨) 17g
植物蛋白胨(或大豆蛋白胨) 3g
氯化钠 100g
磷酸氢二钾 2.5g
葡萄糖 2.5g
蒸馏水 1000mL
3.1.2 制法
将上述成分混合，加热并轻轻搅拌至完全溶解，分装后，于 121℃下高压灭菌 15min，溶液的最终 pH 为 7.3±0.2。3.2 7.5%氯化钠肉汤
3.2.1 成分
蛋白胨 10g
牛肉膏 3g
氯化钠 75g
蒸馏水 1000mL
3.2.2 制法
将上述成分加热溶解，校正 pH 为 7.4，分装试管，于 121℃下高压灭菌 15min。
3.3 血琼脂平板
3.3.1 成分
pH 7.4～7.6 豆粉琼脂 100mL
脱纤维羊血(或兔血) 5～10mL
3.3.2 制法
加热溶化琼脂，冷至 50℃，以灭菌手续加入脱纤维羊血，混匀，倾注平板。亦可分装灭菌试管，置成斜面。亦可用其他营养丰富的基础培养基配制血琼脂。
3.4 Baird-Parker 琼脂平板
3.4.1 成分
胰蛋白胨 10g
牛肉膏 5g
酵母膏 1g
丙酮酸钠 10g
甘氨酸 12g
氯化锂(LiCl·6H2O) 5g
琼脂 20g
蒸馏水 950mL
3.4.2 增菌剂的配法
30%卵黄盐水 50mL 与除菌过滤的 1%亚碲酸钾溶液 10mL 混合，保存于冰箱内。
3.4.3 制法
将各成分加到蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解。冷至 25℃，校正 pH 为 7.5。分装每瓶95mL，于 121℃下高压灭菌 15min。临用时加热溶化琼脂，冷至 50℃，每 95mL 加入预热至50℃的卵黄亚碲酸钾增菌剂 5mL，混匀后倾注平板。培养基应是致密不透明的。使用前在冰箱储存不得超过 48h。
3.5 肉浸液肉汤
3.5.1 成分
绞碎牛肉 500g
氯化钠 5g
蛋白胨 10g
磷酸氢二钾 2g
蒸馏水 1 000mL
3.5.2 制法
将绞碎之去筋膜无油脂牛肉 500g 加蒸馏水 1000mL，混合后放冰箱过夜，除去液面之浮油，隔水煮沸半小时，使肉渣完全凝结成块，用绒布过滤，并挤压收集全部滤液，加水补足原量。加入蛋白胨、氯化钠和磷酸盐，溶解后校正 pH 为 7.4～7.6 煮沸并过滤，分装烧瓶，于 121℃下高压灭菌 30min。
3.6 灭菌盐水
3.7 兔血浆
3.7.1 成分
柠檬酸钠 3.8g
蒸馏水 100mL
兔血 全血
3.7.2 制法
取柠檬酸钠 3.8g，加蒸馏水到 100mL，溶解后过滤，装瓶，121℃高压灭菌 15min。取3.8%柠檬酸钠溶液一份加兔全血四份，混好静置之，则血球下降，即可得血浆进行试验。
4 设备和材料
4.1 显微镜
4.2 恒温箱，36±1℃
4.3 离心机
4.4 灭菌吸管，1 mL、10 mL
4.5 灭菌试管
4.6 灭菌平皿
4.7 均质器
4.8 载玻片
4.9 L型涂布棒
4.10 酒精灯
4.11 接种环
5 操作步骤
5.1 增菌培养法
5.1.1 检样处理
固体样品称取25 g；液体样品吸取25 mL，加入225 mL灭菌生理盐水，混匀。
5.1.2 增菌及分离培养
吸取5 mL上述混悬液，接种于7.5%氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤50 mL培养基内，置363±1℃温箱培养24h，转种血平板和Baird-Parker平板，36±1℃培养24 h，挑取金黄色葡萄球菌菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。
5.1.3 形态
本菌为革兰氏阳性球菌，排列是葡萄球状，无芽胞，无荚膜，致病性葡萄球菌菌体较小，
直径约为0.5～1?m。
5.1.4 在肉汤中呈混浊生长，在胰酪胨大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈混浊生长，血
平板上菌落呈金黄色，也有时为白色，大而突起、圆形、不透明、表面光滑，周围有溶血圈。在Baird-Parker平板上为圆形、光滑凸起、湿润、直径为2～3 mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。
5.1.5 血浆凝固酶试验
吸取1：4新鲜兔血浆0.5 mL，放入小试管中，再加入培养24 h的金黄色葡萄球菌浸液肉汤培养物0.5 mL，振荡摇匀，放36±1℃温箱或水浴内，每半小时观察一次，观察6 h，如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者，被认为阳性结果。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。
5.2 直接计数方法
5.2.1 吸取上述1：10混悬液，进行十倍递次稀释，根据样品污染情况，选择不同浓度的稀释液1 mL，分别加入三块Baird-Parker平板，每个平板接种量分别为0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL，然后用灭菌L棒涂布整个平板。如水分不多吸收，可将平板放在36±1℃温箱1 h，等水分蒸发后反转平皿置36±1℃温箱培养。
5.2.2 在三个平板上点数周围有混浊带的黑色菌落，并从中任选5个菌落，分别接种血平板，36±1℃24 h培养后进行染色镜检、血浆凝固酶试验，步骤同增菌培养法。
5.2.3 菌落计数：将三个平板中疑似金黄色葡萄球菌黑色菌落数相加，乘以血浆凝固酶阳性数，除以 5，再乘以稀释倍数，即可求出每克样品中金黄色葡萄球菌数。
6 参考文献
GB 4789.10— 1994 “食品卫生微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验”。