百欧博伟对志贺氏菌的检验情况-ATCC菌种
中国微生物菌种查询网 / 2018-09-11 16:05:27
百欧博伟对志贺氏菌的检验情况-ATCC菌种
1.范围本标准规定了食品中志贺氏菌的检验方法。本标准适用于各类食品和食物中毒样品中志贺氏菌的检验。
2.规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的墩新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
3.设备和材料
3.1冰箱：0℃～4℃。
3.2恒温培养箱：36℃士1℃，42℃。
3.3显微镜：10*～l00*。
3.4均质器或灭菌乳钵。
3.5架盘药物天平：0g一500g，精确至0.5g。
3.6灭菌广口瓶：500mL。
3.7灭菌锥形瓶：500mL、250mL。
3.8灭菌培养皿：直径90mm。
3.9硝酸纤维素滤膜：150mm*50mm，Φ0.45um。临用时切成两张，每张70mm*50mm，用铅笔划格，每格6mm*6mm。每行10格，分6行。灭菌备用。
4.培养基和试荆
4.1 GN增菌液：按GB/T4789.28一2003中4.17规定。
4.2 HE琼脂：按GB/T4789.23一2003中4.21规定．
4.3 SS琼脂：按GB/T4789.28一2003中4.22规定。
4.4 麦康凯琼脂：按GB/T4789.28一2003中4.24规定。
4.5 伊红美蓝琼脂（EMB)：按GB/T4789.28一2003中4.25规定。
4.6 三糖铁琼脂（TSI)：按GB/T4789.28一2003中4.26、4.27规定。
4.7 葡萄糖半固体管：按GB/T47名9.28一2003中连，31规定。
4.8 半固体管：按GB/T4789.28一2003中4.30规定。
4.9 葡萄糖钱琼脂：按GB/T4789.28一2003中3.8规定。
4.10 尿素琼脂（pH7.2)：按GB/T4789.28一2003中3.15规定。
4.11 西蒙氏柠檬酸盐琼脂：按G曰T47豹．28一2。的中3.5规定。
4.12 氰化钾（KCN）培养基：按G酬T4789.28一2。。3中3.16规定。
4.13 氨基酸脱按酶试验培养基：赖氨酸、鸟氨酸及对照培养基，按GB/T4789.28一2003中3.12规定。
4.14糖发酵管：棉子糖、甘露醇、甘油、七叶昔及水杨普，按GB/T4789.28一2003中3.2规定。
4.15 5％乳糖发酵管：按GB/T4789.28一2003中4.32规定
4.16蛋白豚水、靛基质试剂：按GB/T4789,28一2003中3.13规定4.17志贺氏菌属诊断血清。
5.检验程序：志贺氏菌检验程序见
6.操作步骤
6.1前增菌和增菌冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品均应经过前增菌。以无菌操作取器g(mL)，加在装有225mL缓冲蛋白陈水的500mL广口瓶内。固体食品可先应用均质器以8000r/min——10000r／min,或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用灭菌匙或玻棒研磨使乳化，于36℃士1℃培养4h（干蛋品培养18h——24h)，移取10mL，转种于100mL氯化镁孔雀绿增菌液或四硫酸钠煌绿增菌液内，于42℃培养18h——24h。同时，另取10mL，转种于100mL亚硒酸盐胧氨酸增菌液内，于36℃士1℃培养18h——24h。鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必经过前增菌。各取25g〔25mL）加人灭菌生理盐水25mL，按前法做成检样匀液；取25mL，接种于100mL氯化镁孔雀绿增菌掖或四硫磺酸钠煌绿增菌液内，于42℃培养24h；另取25mL接种于100mL亚硒酸盐胧氨酸增菌液内，于36℃士1℃培养18h——24h。
6.2分离取增菌液1环，划线接种于一个亚硫酸秘琼脂平板和一个DHL琼脂平板（或HE琼脂平板、WS或SS琼脂平板）。两种增菌液可同时划线接种在同一个平板上。于36℃士1℃分别培养18h——24h(DHL、HE、WS、SS）或4oh——48h(BS)，观察各个平板上生长的菌落，沙门氏菌I、II、IV、V、VI和沙门氏菌皿在各个平板上的菌落特征见表l。
6.3生化试验
6.3.1自选择性琼脂平板上直接挑取数个可疑菌落，分别接种三糖铁琼脂。在三糖铁琼脂内。
6.3.2在接种三糖铁琼脂的同时，再接种蛋白膝水（供做靛基质试验）、尿素琼脂（pH7.2）、氰化钾(KCN）培养基和赖氨酸脱叛酶试验培养基及对照培养藻各一管，于36℃士1℃培养18h～24h，必要时可延长至48h，按表3判定结果。按反应序号分类，沙门氏菌属的结果应属于Al、AZ和B1，其他5种反应结果均可以排除。
6.3.2.1反应序号Al：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、氰化钾和赖氨酸三项中有一项异常，按表4可判定为沙门氏菌。如有两项异常，则按A3判定为弗劳地氏柠檬酸杆菌。6.3.2.2反应序号AZ：补做甘露醇和山梨醇试验，按表5判定结果。
6.3.2.3反应序号Bl：补做ONPG。ONPG＋为大肠埃希氏菌，ONPG一为抄门氏菌。同时，沙门氏菌应为赖氨酸＋，但甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸一。
6.3.2.4必要时按表6进行沙门氏菌生化群的鉴别。
6.4血清学分型鉴定
6.4.1抗原的准备一般采用1.5％琼脂斜面培养物作为玻片凝集试验用的抗原。O血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的〔如2.5％一3%）培养基上再检查；如果是由于vi抗原的存在而阻止了O凝集反应时，可挑取菌苔于1mL生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。H抗原发育不良时，将菌株接在0.7%——0.8％半固体琼脂平板的中央，侠菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有0.3%～0.4％半固体琼脂的小玻管1次一2次，自远端取菌培养后再检查。
6.4.2 0抗原的鉴定用A——F多价。血清做玻片蔓集试验，同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙形菌株，不能分型。被A——F多价O血清凝集者，依次用04;03、10；07;08;09;02和011因子血清做凝集试验。根据试验结果，判定O群。被03、10。血清凝集的菌株，再用010、015、O34、019单因子血清做凝集试验，根据试验结果，判定O群...被03、10血清凝集的菌株，再用010、015、034、019单因子血清做凝集试验，判定El、EZ、E3、E4各亚群，每一个O抗原成分的最后确定均应根据0单因子血清的检查结果，没有O单因子血清的要用两个O复合因子血清进行核对．不被A——F多价O血清凝集者，先用57种或163种沙门氏菌因子血清中的9种多价0血清检查，如有其中一种血清凝集，则用这种血清所包括的O群血清逐一检查，以确定O群。每种多价O血清所包括的O因子如下：O多价1 A,B,C,D,E,F群（并包括6,14群）0多价2 13,16,17,18,21群O多价3 28,30,35,38,39群O多价4 40,41,42,43群O多价5 44,45,47,48群O多价6 50,51,52,53群O多价7 55,56，弓7,58群O多价8 59,60,61,62群O多价9 63,65,66,67群6.4.3 H抗原的鉴定不常见的菌型，先用163种沙门氏菌因子血清中的8种多价H血清检查，如有其中一种或两种血清凝集．则再用这一种或两种血清所包括的各种H因子血清逐一检查，以确定第1相和第2相的H抗原。8种多价H血清所包括的H因子如下：H多价l a,b,c,d,iH多价2 eh,enx,enz15，fg,gms,gpu,gp,gq,mt,gz51H多价3 k,r,y,z,z10，Iv,lw,lz13,lz28，lz40
H多价4 1,2;1,5;1,6;l,7；z6
H多价5 z4z23；z4z24；z4z32；z29，z35，z36，z38。H多价6：z39，z41,z42,z44
H多价7 z32，z53,z54，z55H多价8 z56，z57,z60,z61，z62每一个H抗原成分的最后确定均应根据H单因子血清的检查结果，没有H单因子血清的要用两个H复合因子血清进行核对。检出第1相H抗原而未检出第z相H抗原的或检出第2相H抗原而未检出第1相H抗原的，可在琼脂斜面上移种1代～2代后再检查。如仍只检出一个相的H抗原，要用位相变异的方法检查其另一个相。单相菌不必做位相变异检查。位相变异试验方法如下：小玻管法：将半固体管（每管约1mL——2ml）在酒精灯上溶化并冷至50℃，取已知相的H因子血清0.05mL～0.lmL，加人于溶化的半周体内，混匀后，用毛细吸管吸取分装于供位相变异试验的小玻管内，俊凝固后，用接种针挑取待检菌，接种子一端。将小玻管平放在平皿内，并在其旁放一团湿棉花，以防琼脂中水分蒸发而干缩，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可以从另一端挑取细菌进行检查。培养墓内血清的浓度应有适当的比例，过高时细菌不能生长，过低时同一相细菌的动力不能抑制。一般按原血清l:200～1：800的量加人。小倒管法：将两端开口的小玻管（下端开口要留一个缺口，不要平齐）放在半固体管内，小玻管的上端应高出于培养基的表面，灭菌后备用。临用时在酒精灯上加热溶化，冷至50℃，挑取因子血清1环，加入小套管中的半固体内，略加搅动，使其混匀，佼凝固后，将待检菌株接种于小套管中的半固体表层内，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可从套管外的半固体表面取菌检查，或转种1％软琼脂斜面，于37℃培养后再做凝集试验。简易平板法：将0.7%～0.8％半固体琼脂平板烘干表面水分，挑取因子血清1环，滴在半固体平板表面，放置片刻，待血清吸收到琼脂内，在血清部位的中央点种待检菌株，培养后，在形成蔓延生长的菌苔边缘取菌检查。
6.4.4 VI抗原的鉴定用vi因子血清检查。已知具有Vi抗原的菌型有：伤寒沙门氏菌，丙型副伤寒沙门氏菌，都柏林沙门氏菌。6.5菌型的判定和结果报告综合以上生化试验和血清学分型鉴定的结果，按照表7或有关沙门氏菌属抗原表判定菌型，并报告结果。
中华人民共和国卫生部2012年5月17日最新颁部了GB4789.5-2012《食品安全国家标准 微生物学检验 志贺氏菌》，该标准于2012年7月17日起实施。该标准已将志贺氏菌增菌条件改为：样品25g（25ml），于225ml志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素中，于41.5℃厌氧培养16~20小时。该标准旨在提高志贺氏菌增菌环节的选择性，以减少杂菌竞争抑制与干扰，提高志贺氏菌的扩增量，最终提高志贺氏菌的检出率。由于即将面对大量250ml三角烧瓶的厌氧培养，常规的厌氧罐与厌氧袋均无法承担，故厌氧工作站（或称厌氧培养箱）即成为该增菌操作的首选设备。