溶血链球菌呈球形或椭圆形,直径0.6-1.0μm,呈链状排列,长短不一,从4-8个至20-30个菌细胞组成不等,链的长短与细菌的种类及生长环境有关。关于国家食品卫生微生物学检验, 在GB/T 4789.11-2003中对ATCC菌种溶血性链球菌的检验范围包括:
本标准规定了食品中溶血性链球菌的检验方法。
本标准适用于各类食品和食物中毒样品中溶血性链球菌的检验。
食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂。
一、设备和材料
1. 恒温培养箱:36℃士1℃。
2.恒温水浴锅:36℃土1℃。
3.冰箱:O℃——4℃。
4.显微镜:10*~l00*。
5.均质器或灭菌乳钵。
6.离心机:4000r/min。
7.架盘药物天平:0g——5009,精确至0.5g。
8.灭菌锥形瓶:100mL。
9.灭菌培养皿:直径90mm。
10.灭菌试管:10mm*100mm、l6mm*160mm。
11.灭菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、5mL、10mL(具0.1mL刻度)。
12.灭菌棉签、镊子等。
二、培养基和试剂
4.1葡萄糖肉浸液肉汤:按GB/T4789.28一2003中4.1规定。在肉浸液肉汤内加人1%葡萄糖。
4.2肉浸液肉汤:按GB/T4789.28一2003中4.1规定。
4.3匹克氏肉汤:按GB/T4789.28一2003中4.62规定。
4.4血琼脂平板:按GB/T4789.28一2003中4.6规定。
4.5人血浆。4.6 0.25%氯化钙。
4.7 0.85%灭菌生理盐水。
4.8杆菌肤药敏纸片(含0.04单位)。
三、检验程序:检验程序见图(略)
四、操作步骤
1.样品处理按无菌操作称取食品检样25g(ml),加人225mL灭菌生理盐水,研成匀浆制成混悬液。
2.培养将上述混悬液吸取5ml,接种于50ml工葡萄糖肉浸液肉汤,或直接划线接种于血平板。如检样污染严重,可同时按上述量接种匹克氏肉汤,经36℃ 土l℃ 培养24h接种血平板,置36℃ 士1℃ 培养24h,挑起乙型血圆形突起的细小菌落,在血平板上分纯,然后观察溶血情况及革兰氏染色,并进行链激酶试验及杆菌肤敏感试验。
3.形态与染色本菌里球形或卵圆形,直径0.5um ——1um链排列,链长短不一,颊者4个~8个细胞组成,长者20个一30个,链的长短常与细菌的种类及生长环境有关;液体培养中易呈长链;在固体培养基中常呈短链,不形成芽抱,无鞭毛,不能运动。
4.培养特性该菌营养要求较高,在普通培养纂上生长不良,在加有血液、血清培养荃中生长较好。溶血性链球菌在血清肉汤中生长时管底呈絮状或颗粒状沉淀。血平板上菌落为灰白色,半透明或不透明,表面光滑,有乳光,直径约0.5mm~0.75mm,为圆形突起的细小菌落,乙型溶血链球菌周围有2mm—4mm。界限分明、无色透明的溶血圈。
5.链激酶试验致病性乙型溶血性链球菌能产生链激酶(即溶纤维蛋白酶),此酶能激活正常人体血液中的血浆蛋白酶原,使成血浆蛋白酶,而后溶解纤维蛋白。吸取草酸钾血浆0.2ml,加0.8ml灭菌生理盐水,混匀,再加人18h~24卜、36℃ 士1℃ 培的链球菌培养物0.5 m及0.25%氯化钙0.25ml(如氯化钙已潮解,可适当加大至0.3%——0.35 %)振荡摇匀,置于36℃ 士1℃ 水中10min,血浆混合物自行凝固(凝固程度至试管倒置,内容物不流动),然后观察凝固块重新完全溶解的时间,完全溶解为阳性,如24h后不溶解即为阴性。
草酸钾人血浆配制:草酸钾0.01g放人灭菌小试管中,再加人5ml血,混匀,经离心沉淀,吸取上清液即为草酸钾人血浆。
6.杆菌肚敏感试验挑取乙型溶血性链球菌液,涂布子血平板上,用灭菌镊子夹取每片含有。.04单位的杆菌肤纸片,放于上述平板上,于36℃ 士1℃ 培养18h—24h,如有抑菌带出现即为阳性,同时用已知阳性菌株作为对照。
溶血性链球菌在自然界中分布较广,存在于水、空气、尘埃、粪便及健康人和动物的口腔、鼻腔、咽喉中,可通过直接接触、空气飞沫传播或通过皮肤、粘膜伤口感染,被污染的食品如奶、肉、蛋及其制品也会对人类进行感染。上呼吸道感染患者、人畜化脓性感染部位常成为食品污染的污染源。