微生物实验室分离之双层平板法的核心优势及实验操作指南！
小杨 / 2026-02-02 10:44:06
百欧博伟生物：双层平板法是微生物学中分离、纯化噬菌体（噬菌体能侵染细菌）的经典方法，也可用于筛选产溶菌酶的微生物、检测微生物的溶菌活性，核心原理是利用上下两层琼脂的不同硬度，形成清晰的噬菌斑/溶菌圈，实现目标微生物的精准分离与计数，操作标准化强、结果辨识度高。
该方法的核心优势：上层软琼脂使噬菌体/溶菌微生物与宿主菌充分均匀接触，噬菌斑/溶菌圈形态规则、边界清晰，易观察和挑取；下层硬琼脂为微生物生长提供稳定的营养基底，避免菌液扩散，保证分离效果。
一、实验原理
底层为硬琼脂平板（琼脂浓度 1.5%~2.0%），铺于培养皿中凝固，作为宿主菌（如
大肠杆菌）和目标微生物（
噬菌体）的生长基础，提供充足营养且形态稳定。
上层为软琼脂培养基（琼脂浓度 0.6%~0.7%），呈液态时与宿主菌菌悬液、待分离样品（含噬菌体）充分混合，快速铺于底层平板表面，凝固后形成薄而均匀的软琼脂层。
若样品中含噬菌体，其会侵染上层的宿主菌，在菌苔上形成透明的噬菌斑（宿主菌被裂解后形成的空斑）；若为筛选溶菌微生物，目标菌会分泌溶菌酶裂解周围宿主菌，形成溶菌圈。
通过挑取单个噬菌斑/溶菌圈，可实现噬菌体/产溶菌酶微生物的纯培养与分离。
二、实验材料
（一）菌种与样品
宿主菌：根据待分离噬菌体的宿主范围选择（如分离
大肠杆菌噬菌体用大肠杆菌 DH5α/BL21，分离金黄色葡萄球菌噬菌体用
金黄色葡萄球菌），提前活化至对数生长期（OD600≈0.5~0.6）。
待分离样品：含噬菌体的样品（如污水、粪便、土壤浸出液、发酵液上清）或待筛选的产溶菌酶微生物菌悬液/样品稀释液。
（二）培养基
需准备底层硬琼脂培养基和上层软琼脂培养基，两者营养成分一致（适配宿主菌生长），仅琼脂浓度不同，常用为LB 双层培养基（适用于肠杆菌科噬菌体），也可根据宿主菌调整为 NA（营养琼脂）、TSA（胰蛋白胨大豆琼脂）等。
培养基类型 琼脂浓度 状态 作用
底层硬琼脂 1.5%~2.0% 固态（高温灭菌后冷却至 50~55℃倒平板） 提供生长基底，防止菌液扩散
上层软琼脂 0.6%~0.7% 半固态（灭菌后冷却至 45~50℃，避免烫伤宿主菌） 使样品与宿主菌充分接触，形成清晰空斑/溶菌圈
注：培养基需提前高压蒸汽灭菌（121℃，20min），冷却至指定温度后使用，避免温度过高导致宿主菌死亡或噬菌体失活。
（三）试剂与耗材
稀释液：无菌生理盐水（0.85% NaCl）、LB 液体培养基（用于样品梯度稀释）；
耗材：无菌培养皿（90mm，提前灭菌烘干）、无菌移液管（1mL、5mL）、无菌离心管（1.5mL、10mL）、无菌吸头、酒精灯、三角瓶、恒温水浴锅、培养箱、无菌操作台；
其他：试管架、记号笔、无菌涂布棒（备用）、冰盒（样品暂存）。
（四）仪器设备
无菌超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱（37℃，适配多数细菌/噬菌体）、恒温水浴锅（45℃、55℃恒温）、台式离心机（可选，用于样品预处理）、紫外分光光度计（可选，检测宿主菌浓度）。
三、实验前准备（无菌操作核心）
所有玻璃器皿、耗材均需经高压蒸汽灭菌，烘干后置于无菌操作台备用；
培养基灭菌后，分别倒入恒温水浴锅：底层培养基 50~55℃恒温，上层培养基 45~50℃恒温，保温待用（避免凝固）；
宿主菌活化：从斜面菌种挑取单菌落，接种至 LB 液体培养基，37℃、180r/min 摇床培养至对数生长期，冰浴暂存（1h 内使用，保证菌活性）；
样品预处理（关键步骤）：待分离样品若为固体（如土壤），按 1:10 比例加入无菌生理盐水，振荡 30min 后静置 10min，取上清；若为液体（如污水），4℃、8000r/min 离心 10min，取上清，去除样品中的固体杂质和杂菌，避免干扰分离结果；
无菌操作台紫外灭菌 30min，通风 10min 后开始操作，全程严格无菌。
四、标准操作步骤（以噬菌体分离为例）
步骤 1：倒底层硬琼脂平板
用无菌移液管吸取15~20mL 冷却至 50~55℃的底层硬琼脂培养基，快速倒入无菌 90mm 培养皿中，轻轻晃动培养皿，使培养基均匀铺满皿底，水平放置于无菌操作台，室温静置 20~30min，待培养基完全凝固，标记皿底（样品名称、稀释度、日期）。
注：培养基量需适中，过少易干裂，过多会导致上层软琼脂铺展不均；凝固后的底层平板需当天使用，避免吸水返潮。
步骤 2：样品梯度稀释
取无菌离心管，依次标记 10⁻¹、10⁻²、10⁻³……10⁻⁸，向每管加入 9mL 无菌生理盐水；用 1mL 无菌移液管吸取 1mL 预处理后的样品上清，加入 10⁻¹ 管，吹打混匀后，再从 10⁻¹ 管吸取 1mL 至 10⁻² 管，依次梯度稀释，根据样品中噬菌体浓度选择合适稀释度（通常选 10⁻⁴~10⁻⁸）。
注：梯度稀释全程无菌，移液管每换一个稀释度需更换，避免交叉污染；若为筛选溶菌微生物，样品稀释至 10⁻³~10⁻⁶即可。
步骤 3：上层软琼脂混合液制备
取无菌试管，标记对应样品稀释度，向每管加入3~5mL 冷却至 45~50℃的上层软琼脂培养基（体积根据培养皿大小调整，90mm 皿加 3~4mL）；
向试管中加入0.1~0.2mL 对数生长期的宿主菌菌悬液，轻轻吹打混匀（避免产生气泡）；
再加入0.1mL 对应稀释度的样品稀释液，再次轻柔混匀（全程试管置于 45℃水浴锅中，防止软琼脂凝固）。
关键注意：①上层软琼脂温度不可超过 50℃，否则会杀死宿主菌和噬菌体；②混匀时避免剧烈振荡，防止产生气泡，气泡会干扰噬菌斑观察；③每一个稀释度单独制备一支上层软琼脂试管，不可共用。
步骤 4：铺上层软琼脂
将混匀后的上层软琼脂混合液快速、均匀地倒在已凝固的底层平板表面，轻轻晃动培养皿，使混合液铺满底层平板，无空白区域、无气泡。水平放置于无菌操作台，室温静置 10~15min，使上层软琼脂完全凝固。
注：铺板动作要快，避免软琼脂在试管中凝固；若出现气泡，可用无菌接种环轻轻挑破。
步骤 5：培养
将双层平板倒置（防止培养过程中冷凝水滴落，冲散菌苔和噬菌斑），置于37℃恒温培养箱培养12~24h（具体时间根据宿主菌生长速度调整，如大肠杆菌培养 12~16h 即可出现清晰噬菌斑）。
步骤 6：观察与挑取单噬菌斑/溶菌圈
培养结束后，取出平板，在自然光或显微镜下观察：菌苔为浑浊的背景，透明、圆形、边界清晰的空斑即为噬菌斑（溶菌微生物则为溶菌圈）。用无菌接种环挑取单个形态规则的噬菌斑/溶菌圈，接种至含宿主菌菌悬液的 LB 液体培养基中，37℃、180r/min 摇床培养 8~12h，使噬菌体增殖/溶菌微生物纯培养，即为初筛的纯培养物，可进行后续的鉴定和纯化。
五、纯化与复筛（保证目标微生物纯度）
初筛得到的培养物可能含杂噬菌体/杂菌，需进行3~5 次纯化，操作如下：
将初筛培养物 4℃、8000r/min 离心 10min，取上清，按上述步骤进行梯度稀释、铺双层平板；
培养后挑取单个形态一致的噬菌斑/溶菌圈，再次接种至宿主菌菌悬液中培养；
重复操作，直至所有平板上的噬菌斑/溶菌圈形态、大小、透明度完全一致，即为纯化的目标微生物（噬菌体/产溶菌酶微生物）。
六、结果判定
（一）噬菌体分离结果
阳性结果：平板上出现透明、圆形、边界清晰的噬菌斑，噬菌斑大小与噬菌体种类相关（小噬菌斑直径 0.5~1mm，大噬菌斑直径 2~3mm），无杂菌污染，菌苔均匀；
阴性结果：平板上全为浑浊菌苔，无透明空斑，说明样品中无目标噬菌体或噬菌体浓度过低；
污染结果：平板上出现杂菌菌落（形态与宿主菌不同）或噬菌斑形态不规则、边界模糊，说明无菌操作不严格或样品预处理不彻底。
（二）溶菌微生物筛选结果
阳性结果为菌苔上出现透明或半透明的溶菌圈，溶菌圈越大，说明微生物的溶菌活性越强；阴性结果为无溶菌圈，菌苔均匀浑浊。
七、关键注意事项（标准化操作 & 质量控制）
（一）无菌操作（核心，避免污染）
全程在无菌超净工作台操作，操作前紫外灭菌，操作中酒精灯旁进行，手、移液管、接种环等需经常灼烧灭菌；
所有耗材、培养基均需彻底灭菌，避免杂菌污染导致菌苔混乱，无法识别噬菌斑/溶菌圈；
梯度稀释和铺板时，移液管、吸头需一用一换，避免交叉污染。
（二）温度控制（决定实验成败）
上层软琼脂温度严格控制在45~50℃：温度过高会使宿主菌死亡、噬菌体失活，导致无噬菌斑；温度过低会使软琼脂提前凝固，无法铺板，混合不均；
底层硬琼脂温度控制在 50~55℃，避免温度过高烫坏培养皿，或过低导致凝固过快，铺板不均。
（三）宿主菌与样品处理
宿主菌需处于对数生长期：此阶段菌活性最强，易被噬菌体侵染，静止期菌活性低，会导致噬菌斑数量减少、形态不清晰；
样品预处理需彻底：固体样品充分振荡浸提，液体样品离心去杂质，避免样品中的固体颗粒、杂菌干扰噬菌体与宿主菌的接触；
样品稀释度需合适：稀释度过低，噬菌斑/溶菌圈过于密集（融合成斑），无法挑取单个；稀释度过高，平板上无空斑或空斑数量过少，无法统计和分离。
（四）平板培养与观察
平板需倒置培养：防止培养过程中冷凝水滴落，冲散上层软琼脂的菌苔和噬菌斑，导致结果混乱；
培养时间需适中：培养时间过短，噬菌斑/溶菌圈未形成；培养时间过长，宿主菌过度生长，会覆盖小型噬菌斑，或杂菌大量繁殖导致污染；
观察后的平板若需保存，置于 4℃冰箱，保存时间不超过 3d，避免噬菌斑变形、菌苔干裂。
（五）其他
软琼脂混合液避免产生气泡：气泡会在平板上形成空白点，易与噬菌斑混淆，挑取时需注意区分；
挑取单噬菌斑时，接种环需灼烧冷却后使用，避免烫伤目标微生物，挑取后及时接种至增殖培养基，防止噬菌体失活。
八、生物安全要求
实验所用宿主菌若为条件致病菌/致病菌（如
金黄色葡萄球菌、
沙门氏菌），需在二级生物安全实验室（BSL-2） 操作，严格遵守生物安全规范；
实验废弃物（如污染的移液管、离心管、培养皿）需置于专用灭菌袋中，高压蒸汽灭菌（121℃，30min）后再处理，避免微生物扩散；
实验结束后，无菌操作台用 75% 乙醇擦拭消毒，紫外灭菌 30min，实验台面、仪器表面用 75% 乙醇消毒。
九、方法拓展应用
噬菌体计数：通过统计不同稀释度平板上的噬菌斑数量，计算样品中噬菌体的效价（PFU/mL，噬菌斑形成单位/毫升），公式：效价 = 噬菌斑数 × 稀释倍数 ×10（因加入样品体积为 0.1mL）；
产溶菌酶微生物筛选：将待筛选微生物菌悬液代替噬菌体样品，铺于含宿主菌的双层平板，通过溶菌圈大小筛选溶菌活性高的菌株；
噬菌体效价测定：双层平板法是噬菌体效价测定的金标准，结果比单层平板法更准确、重复性更好；
噬菌体宿主范围鉴定：更换不同的宿主菌，采用双层平板法，观察是否形成噬菌斑，确定噬菌体的宿主特异性。
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