实验室微生物菌种分离纯化的具体操作步骤与关键注意事项！
小杨 / 2025-05-28 10:01:19
百欧博伟生物：实验室中微生物菌种的分离与纯化是微生物学研究的基础操作，目的是从混合样品中获得单一菌株的纯培养。以下是具体步骤及关键注意事项：
一、准备工作
1、实验材料：
样品来源（土壤、水体、空气、临床样本等）。
培养基（根据目标微生物选择，如LB培养基用于细菌，PDA培养基用于真菌）。
灭菌工具：接种环、涂布棒、移液枪、培养皿、试管等。
无菌操作设备：超净工作台、酒精灯、灭菌锅。
稀释液：生理盐水（0.85% NaCl）或磷酸盐缓冲液（PBS）。
2、灭菌处理：
所有工具和培养基需高压灭菌（121℃, 20分钟）。
超净工作台提前开启紫外灭菌30分钟。
二、样品处理
样品预处理：
固体样品（如土壤）：取1g样品加入9mL无菌稀释液，振荡混匀后静置，取上清液。
液体样品（如污水）：直接梯度稀释（10⁻¹~10⁻⁶）。
富集培养（可选）：若目标菌含量低，可先进行选择性富集培养。
三、分离方法
1、稀释涂布平板法（最常用）
步骤：
梯度稀释样品至10⁻⁵~10⁻⁷（不同样品稀释度需预实验确定）。
取0.1mL稀释液加入固体培养基平板，用无菌涂布棒均匀涂布。
倒置培养（细菌37℃ 24-48h；真菌25-28℃ 3-7天）。
挑取单菌落（形态、颜色均一）至斜面培养基保存。
2、平板划线分离法
步骤：
接种环灼烧冷却后蘸取样品，在平板上分区划线（4-5区，后一区与前区重叠1-2次）。
通过逐区稀释，最终获得单菌落。
3、其他方法：
倾注平板法：适用于严格厌氧菌。
选择培养基法：添加抗生素或特定碳源抑制杂菌。
四、纯化与验证
1、纯化操作：
将单菌落重复划线/涂布2-3次，确保无杂菌。
观察菌落形态、边缘、颜色、透明度等是否一致。
2、纯度验证：
显微镜观察（革兰染色、芽孢染色等）。
生理生化试验（如氧化酶试验、糖发酵试验）。
分子鉴定（16S rRNA测序或ITS测序）。
五、菌种保存
1、短期保存：
斜面培养基4℃保存（细菌1-3个月，真菌3-6个月）。
2、长期保存：
甘油管冷冻（-80℃）：菌悬液与20%-40%甘油混合。
冷冻干燥法（保存期可达10年以上）。
六、注意事项
全程严格无菌操作，酒精灯火焰旁操作。
接种环需灼烧冷却后再接触菌体，避免烫死微生物。
高稀释度与低稀释度平板均需保留，防止目标菌过度稀释。
真菌分离需添加氯霉素（抑制细菌），细菌分离可添加放线菌酮（抑制真菌）。
通过以上步骤，可获得单一微生物的纯培养，为后续研究（如代谢分析、基因编辑等）奠定基础。若实验中出现污染或无法分离目标菌，需检查操作步骤或优化培养基成分。
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