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人风湿性关节滑膜成纤维细胞永生化的操作步骤!
小杨 / 2022-09-23


一、细胞简介
平台编号:Bio-111010
规格:1×10⁶Cells/T25培养瓶
细胞信息:永生化细胞
细胞名称:人风湿性关节滑膜成纤维细胞
用途:(免疫荧光鉴定)
注意事项:仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗,非药用,非食用(产品信息以出库为准)

二、细胞详述
滑膜是关节囊的内层,淡红色,平滑闪光,薄而柔润,由疏松结缔组织组成。关节腔内的所有结构,除关节软骨、半月软骨板以外,即便是通过关节腔的肌腱、韧带等均全部为滑膜所包裹。
滑膜分泌滑液,在关节活动中起重要作用。正常滑膜分为两层,即薄的细胞层(内腔层)和血管层(内膜下层),是血管丰富的关节囊内膜,贴附于非关节面部分,覆盖于关节囊内的骨面上,不在软骨面上,此部分称为边缘区或“裸区”。滑膜呈粉红色,光滑发亮、湿而润滑,有时可见绒毛,内含胶原性纤维。
滑膜细胞有A、B两型。巨噬细胞样A型细胞,表面有丝状伪足、浆膜内陷、囊泡、线粒体、溶酶体、胞浆纤维和高尔基体,具有吞噬功能;B型成纤维
样滑膜细胞(FLS) ,有高浓度的内质网结构,是介导 RA 关节破坏的主要细胞。
该细胞通过慢病毒转染的方式携带SV40基因。

三、细胞特性
1)细胞来源于手术取得人正常关节滑膜组织。
2)细胞鉴定:纤维连接蛋白(Fibronectin)或波形蛋白(Vimentin)免疫荧光染色为阳性。
3)经鉴定细胞纯度高于90%。
4)不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。
5)细胞生长方式:成纤维样细胞,贴壁培养。
我们推荐使用原代成纤维细胞培养体系作为体外培养关节滑膜成纤维细胞的培养基。
名称 体积 浓度 保存条件 
原代成纤维细胞基础培养基 500ml 1× 4℃、避光 
原代成纤维细胞培养添加剂 5ml 100× -20℃、避光 
胎牛血清(FBS) 50ml 终浓度10% -20℃、避光 
双抗(青霉素/链霉素,P/S) 5ml 100× -20℃、避光 

四、产品的运输和保存
视天气状况和运输距离远近,公司与客户协商后选择下述方式中的一种进行。
(1)1mL冻存细胞悬液装于1.8ml的冻存管中,置于装满干冰的泡沫保温盒中进行运输;收到细胞后请尽快解冻复苏细胞进行培养,如无法立刻进行复苏操作,冻存细胞可在-80℃的条件下保存1个月。
(2)T-25培养瓶充满完全培养基后进行常温运输;收到细胞后请镜下观察细胞生长状态,如铺瓶率超过85%请立即进行传代操作,如悬浮的细胞较多,请将培养瓶至于培养箱中静置过夜以帮助未死亡的悬浮细胞能够再次贴壁。

五、产品使用
(1)本产品仅能用于科研
(2)本产品未通过直接用于活体动物和人的审核
(3)本产品未通过用于活体诊断的审核

六、细胞传代步骤
如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。
1、弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2、加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中,置于37℃培养箱中消化1-2分钟,然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3、按6-8ml/瓶补加培养基,轻轻打匀后吸出,在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养液后吹匀。
4、将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

七、细胞复苏步骤
将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻,加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入10cm皿中,加入约8ml培养基,培养过夜)。第二天换液并检查细胞密度。

八、细胞冻存步骤
待细胞生长状态良好时,可进行细胞冻存。
下面T25瓶为例;
1、细胞冻存时,弃去培养基后,PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶,细胞变圆脱落后,加入2ml完全培养基终止消化,可使用血球计数板计数。 
2、1000RPM离心5分钟去掉上清。用血清重悬浮,加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀,按每1ml的数量分配到冻存管中,注意冻存管做好标识。本公司按每个冻存管细胞数目大于1X106个细胞冻存。
3、将冻存管置于程序降温盒中,放入-80度冰箱,至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

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