一、背景
SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞建系于1970年，是神经母细胞瘤SK-N-SH细胞系经三次克隆后的亚系(SK-N-SH→SH-SY→SH-SY5→SH-SY5Y)。该细胞显示中等水平的多巴胺-β-羟基酶活性。
二、细胞培养步骤
1、培养基及培养冻存条件准备：
1）准备MEM和F-12（培养基（1:1）；优质胎牛血清10%；Gluta-max,1%;NEAA,1%;Sodium pyruvate,1mM;双抗，1%。
备注：该细胞为贴壁和悬浮同时存在，换液和传代时需要回收悬浮细胞，否则细胞会越来越少。
2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。
3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。
2、细胞处理：
2）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，离心管加入4mL培养基混合均匀。在800-1000RPM条件下离心4-5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入T25培养瓶中培养，补加培养基至6ml。
3）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
1.将上清取出，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量完全培养基终止消化。
3.轻轻打匀后吸出，和上清一起在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，加1-2mL培养液后吹匀。
4.将细胞悬液按1：2到1:5比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中。
3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。
三、应用
用于EV71病毒通过上调miR-146a诱导人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y焦亡的机制研究：
证明EV71感染可引起SH-SY5Y细胞发生焦亡;进一步探讨了EV71诱导SH-SY5Y细胞焦亡可能的分子机制。
方法：在前期研究工作中,运用RIP芯片技术检测了人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y感染EV71后细胞内差异表达的miRNAs;在众多差异表达的miRNAs中,通过RT-q PCR验证了部分差异表达的基因,并初步确定了可能与细胞焦亡相关的miRNA分子,miR-146a;运用生物信息学技术,从Targetscan、miRNA、miRDB、Pictar、miRTar Base这五种数据库进行分析对比结合查阅文献寻找到miR-146a下游3个可能与焦亡相关的靶基因TRAF6、CXCR4、BRCA1;运用RT-q PCR、Western blot技术验证上述通过生物信息学手段选出的3个靶基因,初步确定了TRAF6、CXCR4为miR-146a下游靶基因;运用Western blot技术确定EV71诱导SH-SY5Y细胞发生焦亡的情况;使用miR-146a-inhibitor来调节细胞内miR-146a的表达变化后,检测EV71感染后细胞焦亡水平的变化;使用Phace-TRAF6、Phace-CXCR4过表达细胞内TRAF6、CXCR4后,再检测EV71感染后细胞焦亡水平的变化;此外,运用TUNEL实验检测了EV71感染SH-SY5Y后细胞凋亡的情况。
结果：Western blot结果显示细胞感染EV71后,细胞内焦亡相关蛋白caspase-1、GSDMD、NLRP3、IL-1β的表达增加,这说明病毒可诱导细胞焦亡发生;与此同时,RT-q PCR结果显示EV71感染的SH-SY5Y细胞中miR-146a的表达水平增加;
通过转染miR-146a-inhibitor下调细胞内miR-146a的表达后,EV71感染的SH-SY5Y细胞焦亡相关蛋白caspase-1、GSDMD、NLRP3、IL-1β表达明显降低,这说明miR-146a-inhibitor可逆转病毒诱导的细胞焦亡;
结合生物信息学技术及文献查阅,初步确定了TRAF6、CXCR4为miR-146a下游靶基因;不仅如此,Western blot和RT-q PCR结果显示EV71感染细胞后,可下调细胞内TRAF6和CXCR4表达;
当通过转染miR-146a-inhibitor下调细胞内miR-146a的表达后,TRAF6、CXCR4的表达增加,这提示miR-146a与TRAF6、CXCR4存在靶向关系,且呈负相关;
接下来过表达细胞内的TRAF6和CXCR4后,再次检测EV71感染细胞后细胞内焦亡相关蛋白的表达变化,结果显示caspase-1、GSDMD、NLRP3、IL-1β表达减少,这表明过表达细胞内的TRAF6和CXCR4可逆转病毒诱导的细胞焦亡;此外,TUNEL实验结果证明,EV71感染SH-SY5Y细胞后可诱导细胞发生凋亡。
结论：上述实验结果提示,EV71可上调细胞内miR-146a的表达,同时诱导SH-SY5Y细胞出现焦亡及凋亡;当下调细胞内miR-146a的表达水平时,EV71诱导SH-SY5Y细胞焦亡的作用可被逆转;当分别上调细胞内TRAF6和CXCR4的表达水平时,EV71诱导SH-SY5Y细胞焦亡的作用也可被逆转。
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