微生物菌种查询网是一个专为科研人员进行微生物菌种查询的技术型网站,由包括北京百欧博伟生物技术有限公司在内的多家企事业单位及院所共同打造!网站隶属于北京百欧博伟生物技术有限公司,并由其进行更新维护,会根据资源内容及菌种数量进行不定时更新,旨在讲最全面的微生物菌种信息呈现给广大微生物科研技术人员!
        从成立之日至今,微生物菌种查询网已收录并更新的国内外菌种资源达10万余株,其中,国内7万余株,国外2万余枚!网站也对细胞资源信息进行了收录,目前达到了国内外细胞资源总量超过1万余枚,基本可以满足大部分科研人员的查询需求!同时我们也罗列了5千余套培养基配方,部分已以文字的形式免费呈现在网站中!而且我们技术人员已经在对常用质粒载体进行设计构建,并且可提供查询的有400余枚!经过工作人员的不懈努力,网站中的资源信息每天都在增加,信息内容每天都在丰富,方便了大批需要进行微生物查询的科研技术人员,满足了众多企事业单位及科研院所的需求…………查看更多

首页 / 技术提供 / BHK-21(仓鼠肾细胞)的培养步骤与应用!
BHK-21(仓鼠肾细胞)的培养步骤与应用!
小杨 / 2022-06-23


一、背景

BHK-21细胞是由IA-Macpherson和M-G.P-Stoker于1961年3月从1日龄的仓鼠建立的。随后84天连续培养,仅中断8天进行冻存。通过单细胞分离建立了13号克隆,即BHK-21。BHK-21细胞可用作转染宿主,用于表达包含选择及扩增标记的DNA的载体。

二、培养步骤

1)复苏细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻,加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟,弃去上清液,补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入6cm皿中),培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2)细胞传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。

1.弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1-2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中,置于37℃培养箱中消化1-2min,然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

3.轻轻吹打细胞,完全脱落后吸出,在1000RPM条件下离心8-10分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养液后吹匀。

4. 按5-6ml/瓶补加培养液,将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

3)细胞冻存:待细胞生长状态良好时,可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时,弃去培养基后加入少量胰酶,细胞变圆脱落后,进行离心收集,1000RPM条件下离心8-10分钟,去除上清,按冻存数量加入血清及DMSO,冻存比例为90%FBS+10%DMSO。

三、应用

用于BHK-21细胞无血清悬浮培养生产新城疫病毒研究:

新城疫(Newcastle disease,ND)因其高发病率和高死亡率给世界各地的家禽养殖业造成了巨大威胁,接种疫苗是防控ND最有效的措施。采用传统的鸡胚工艺生产新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)疫苗,存在SPF鸡胚供应不足、质量控制困难及规模放大受限等问题;基于细胞的贴壁培养工艺存在成本高、操作复杂和过程控制困难等缺点;而应用无血清悬浮培养工艺虽可克服上述缺陷,但存在缺乏对NDV敏感的悬浮细胞系、适于NDV扩增的无血清维持培养基及工艺不成熟等问题。针对上述问题,亟需开发基于动物细胞的NDV悬浮培养工艺及适于NDV增殖的无血清维持培养基。

以实验室自主研发的无血清培养基SF201为生长及维持培养基,通过敏感细胞株筛选、病毒适应及细胞毒种制备、病毒接种条件优化,建立了无血清悬浮培养生产NDV工艺。当BHK-v002细胞生长至约9.0×106cells/mL时,用新鲜培养基将活细胞密度稀释至6.0×106 cells/mL,在MOI为0.005、TPCK-胰酶浓度为5μg/mL条件下接种病毒,继续培养96 h后收获病毒,收获病毒液的血凝效价(HA效价)为8.5 log2HAU/25μL,单细胞产毒量(Svy)达到1685.9virions/cell。为进一步优化培养过程,提高病毒产量,应用Design Expert软件对6种无血清培养基进行混料设计,成功筛选出无血清维持培养基BMM11,培养后收获的病毒上清液中HA效价和Svy分别达到9.5 log2HAU/25μL和3185.1 virions/cell。以8 g/L浓度的F水解物添加至BMM11培养基(BMM11-F),HA效价和Svy分别达到10.4 log2HAU/25μL和6981.5 virions/cell。

为指导成分明确的无血清维持培养基的研制,考察了维持培养基BMM11及关键组分葡萄糖和谷氨酰胺对细胞生长、代谢和病毒增殖的影响。在维持培养基BMM11中病毒增殖后期葡萄糖和Gln耗竭不利于病毒的增殖和细胞活性的维持;高浓度葡萄糖所致的酸性pH环境降低病毒滴度,故应控制葡萄糖补加量;当Gln添加量为4.088 g/L时,病毒HA效价和Svy分别为10.5 log2HAU/25μL和6704.4 virions/cell,与BMM11-F培养基相当。

微生物菌种查询网自设细胞系板块,是细胞株提供中心,专业提供代次低、周期短、活性好的细胞株。与国内外多家研制单位,生物医药,第三方检测机构,科研院所有着良好稳定的长期合作关系!欢迎广大客户来询!

  • 下载附件
  • 上一篇:副溶血弧菌的菌株性质与生存环境及检测方法!
  • 下一篇:腐皮镰孢的培养条件与实验内容及打管说明!