出口食品中弓形菌的检测标准
中国微生物菌种查询网 / 2018-10-09 08:53:12
中国微生物菌种查询网弓形菌为变形菌门Σ-变形菌纲弯曲菌目弯曲菌科的一个新属。呈弯曲或螺旋形杆状，不产芽孢，最佳生长氧气浓度为微量氧气（3%-10%），正常大气氧浓度条件下也可生长的革兰氏阴性细菌。
本标准规定了食品中弓形菌的检验方法。
本标准适用于食品中布氏弓形菌、嗜低温弓形菌和斯氏弓形菌的检验。
一、设备和材料
除微生物实验室常规灭菌与培养设备外，其他设备与材料如下：
1 冰箱：2℃-8℃。
2 恒温培养箱：25℃±1℃，30℃±1℃，36℃±1℃。
3 水浴或其他恒温装置：30℃±1℃，98℃。
4 微需氧培养装置：提供微需氧条件（5%氧气、10%二氧化碳和85%氮气）。
5 电子天平：感量0.1g。
6 均质器。
7 过滤装置及滤膜（0.22μm，0.45μm）。
8 显微镜：10×~100×,有相差功能。
9 离心机:离心机大于等于20000g。
10 核酸蛋白分析仪。
11 基因扩增仪。
12 电泳仪。
13 凝胶成像分析系统。
二、培养基和试剂
除有特殊说明外，所有试验用试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T 6682中一级水的要求。
1 JM肉汤
2 JM琼脂
3 弓形菌琼脂
4 布氏肉汤
5 布氏琼脂
6 氧化酶试剂
7 三糖铁琼脂
8 Hugh-Leifson培养基
9 马尿酸钠水解试剂
10 吲哚乙酸纸片
11 Mueller Hinton血琼脂
12 1mol/L,Tris-HCL缓冲液（pH8.0):称取121.1gTris,溶于800ml水中，搅拌，加入浓盐酸42ml，冷却至室温，用稀盐酸准确调整pH至8.0，分装后高压灭菌备用。
13 0.5mol/L EDTA(pH8.0)：在800ml水中加入186.1gNa-EDTA*2H2O,在磁力搅拌器剧烈搅拌，用氢氧化钠调节浓度pH值至8.0（约20g氢氧化钠颗粒），然后定容至1L，分装后高压灭菌备用。
14 DNA提取液：量取100ml1mol/L Tris-HCL,50ml0.5mol/LEDTA,称取5.0gSDS,16.848g氯化钠，定容至1L，分装后高压灭菌备用。
15 Taq乘合酶。
16 dNTP:dATP,dTTP,dCTP,dGTP。
17 10×PCR缓冲液:100 mmol/L氯化钾，160 mmol/L硫酸铁，20 mmol/L硫酸镁.200 mmol/LTris-Hα(pH8.8)，1 % TritonX-100, 1 mg/mL BSA。
18 DNA Marker。
19 质控参考菌株:布氏弓形菌ATCC 49616、嗜低温弓形茵ATCC 43158和斯氏弓形菌ATCC51332(或共他可溯源的菌株)。
20 10×上样缓冲液:0.25%溴酚蓝，40%蔗糖。
21 琼脂糖:电泳级。
22 溴化乙锭:10 mg/mL。
23 50×TAE电泳储备液：称取484 g Tris，量取114.2mL乙酸，200 mL 0.5mol/LEDTA(pH8.0),溶于蒸馏水中,定容至2 L。分装后高压灭菌备用。
三、样品处理
1、 一般样品
取25 g(或25 mL)样品加入盛有225 mL JM肉汤的有滤网的均质袋中(无滤网的均质袋可使用无菌纱布过滤)，用拍击式均质器均质1 min-2 min；或加入盛有225 mL JM肉汤的均质杯中.以8 000r/min-10 000 r/min均质1min-2 min,经滤网或克菌纱布过。.将滤液进行培养。
2、整禽等样品
用200 mL0.1%的蛋白胨水充分冲洗样品的内外部,并振荡2min-3min,经无菌纱布过滤至250 mL离心管中,16 000 g离心15 min后弃去上清,用10 mL0.1%蛋白胨水悬浮沉淀,吸取3mL于100 mL JM肉汤中。
3、需表面涂拭检测的样品
无菌棉签涂布样品表面(面积为50 cm2-100 cm2).将棉签头剪落到100 mL JM肉汤中进行培养。
4、 水样
将4L的水（对于氯处理的水过滤前每升水中加人5 mL 1mol/L硫代硫酸钠溶液)经0.45μm.滤膜过滤,将滤膜浸没在100 mL JM肉汤中进行培养。
5、 增菌
30℃土1℃培养44 h士4 h。必要时测定增菌液的pH值并调整至7.2士0.2。
6、 分离
增菌液划线接种于JM琼脂与弓形茵掠脂平板上,30℃士1℃培养24 h-48 ho观察24 h培养与48 h培养的琼脂平板上的菌落形态。弓形菌在JM琼脂平板上形成灰色至白色、有或无红色晕轮、圆形、宜径约为1 mm-2 mm的菌落；弓形菌在弓形菌琼脂上形成半透明、浅黄色、光滑、圆形、宜径约为1 mm-2 mm的菌落。
四、 形态观囊
挑取可疑菌落进行革兰氏染色,镜检。
1、 动力观察
挑取可疑茵落用1 mL布氏肉汤悬浮,用相羞显微镜观察运动状态.
2、 氧化酶试验
用铂/铱接种环或玻璃棒挑取可疑菌落至氧化酶试剂润湿的滤纸上,如果在10 s内出现紫红色、紫罗兰或深蓝色为阳性。
3、 微需氧条件下25℃生长斌验
挑取可疑菌落,接种到哥伦比亚血琼脂平板上,微需氧条件下25℃土1℃培养44 h土4 h,观察细菌生长情况。
4、 三糖铁(TSI)生长试验
挑取可疑菌落,穿刺并划线接种到TSI高层斜面.30℃土1℃墙养24 h-48 h，观察细菌生长情况。弓形菌不产H2S，多数弓形菌产碱，底层和斜面均为红色。
5、 Hugh-Leifson培养基穿刺生长
挑取可疑菌落,穿刺接种Hugh-Leifson培养基,30℃士1℃培养44h土4 h,弓形菌可在穿刺线周围出现混浊生长.不发酵葡萄塘,培养基仍为蓝色。
6、 马尿酸钠水解试验
挑取菌落，加到盛有0.4 mL 1%马尿酸钠的试管中制成菌悬液。混合均匀后在36℃±1℃水浴放置2 h或36℃土1℃培养箱中放置4 h。沿着试臂壁缓缓加人0.2 mL茚三酮溶液,不要振荡,在36℃士1℃的水浴或培养箱中放宜10 min后判读结果。若出现深紫色则为阳性；出现淡紫色或没有颜色变化则为阴性。
7、 吲哚乙酸酯水解试验
挑取菌落至吲哚乙酸酯纸片上,再滴加一滴灭菌水。如果吲哚乙酸酯水解，则在5 min-10min内出现深蓝色;若无颜色变化则没有发生水解。
五、弓形菌检验程序（如图）
