ATCC菌种双歧杆菌Y1-4A-01 [CCRC 910051]的检验
中国微生物菌种查询网 / 2018-08-30 09:54:48
ATCC菌种双歧杆菌是一种革兰氏阳性、不运动、细胞呈杆状、一端有时呈分叉状、严格厌氧的细菌属，广泛存在于人和动物的消化道、阴道和口腔等生境中。双歧杆菌属的细菌是人和动物肠道菌群的重要组成成员之一。一些双歧杆菌的菌株可以作为益生菌而用在食品、医药和饲料方面。对于双歧杆菌的检验可分为以下几步。
一、 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。
2 冰箱：2 ℃～5 ℃。
3 天平：感量0.1 g。
4 无菌试管：18 mm×180 mm、15 mm×100 mm。
5 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及配套吸头。
6 无菌培养皿：直径90 mm。
二、 培养基和试剂
1 甲醇：分析纯。
2 三氯甲烷：分析纯。
3 冰乙酸：分析纯。
4 乳酸：分析纯。
5 乙酸标准溶液：吸取分析纯冰乙酸5.7 mL，移入100 mL容量瓶中，加水至刻度，标定方法见附录B.1，此溶液浓度约为1 mol/L。
6 乳酸标准溶液：吸取分析纯乳酸8.4 mL，移入100 mL容量瓶中，加水至刻度，标定方法见附录B.1，此溶液浓度约为1 mol/L。
三、 操作步骤
1 全部操作均应遵循无菌操作程序。
2 食品用双歧杆菌纯菌菌种的鉴定及计数
接种：半固体或液体菌种直接接种在双歧杆菌琼脂平板。真空冷冻干燥菌种，先加适量灭菌生理盐水，溶解菌粉，然后接种在双歧杆菌琼脂平板。平板在36 ℃±1 ℃厌氧培养48 h±2 h。
涂片镜检：双歧杆菌为革兰氏染色阳性，不抗酸、无芽孢、无动力，菌体形态多样，呈短杆状、纤细杆状或球形，可形成各种分支或分叉形态。
生化鉴定：挑取5.2.1.1步骤中的平板上生长的单个菌落，进行生化反应检测。双歧杆菌的过氧化氢酶试验为阴性。不同双歧杆菌菌种的主要生化反应见表1。
3 样品的稀释
取1.0 g固体菌种溶解于9.0 mL生理盐水或其它稀释液，制成1:10的样品匀液。
用1 mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1.0 mL，沿管壁缓慢注于装有9.0 mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。
另取1 mL无菌吸管或吸头，按5.2.2.2.1操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，即换用1次1 mL灭菌吸管或吸头。
根据对样品双歧杆菌浓度的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液，在进行10倍递增稀释时，吸取1.0 mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1.0 mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。
及时将 15 mL～20 mL冷却至 46 ℃的双歧杆菌琼脂培养基（可放置于46 ℃±1 ℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。
4 培养
待琼脂凝固后，将平板翻转，36 ℃±1 ℃厌氧培养48 h±2 h。
5 菌落计数
可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落
形成单位（colony-forming units，CFU）表示。
选取菌落数在30 CFU～300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30 CFU的平板记录具体菌落数，大于300 CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。
当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。
6 食品中双歧杆菌的鉴定及计数
称重取样25.0 g，或体积取样25.0 mL，置于装有225 mL稀释液的灭菌锥形瓶内，制成1:10的样品匀液。
将上述样品匀液接种在双歧杆菌琼脂平板。平板在36 ℃±1 ℃厌氧培养48 h±2 h。
纯培养
挑取3个或以上的单个菌落接种于双歧杆菌琼脂平板。平板在36 ℃±1 ℃厌氧培养48 h±2 h。
四、检验程序
双歧杆菌的检验程序见下图：
