厌氧肉肝汤培养基的原理与质量控制及配制与使用方法！
小杨 / 2026-03-20 09:13:32
厌氧肉肝汤培养基是一种液体非选择性培养基，主要用于厌氧菌的增菌培养，可支持绝大多数厌氧菌（包括专性厌氧菌、兼性厌氧菌）的生长繁殖，广泛应用于临床标本和环境样本中厌氧菌的初步富集。
一、培养基原理
1、营养供给体系
牛肉膏、蛋白胨：提供厌氧菌生长所需的碳源、氮源、维生素及矿物质等基础营养。
肝浸液：是核心营养成分，富含血红素、辅酶等厌氧菌生长必需的因子，可促进
脆弱拟杆菌等苛养厌氧菌的生长。
葡萄糖：作为快速利用的碳源，为厌氧菌提供能量，同时部分厌氧菌发酵葡萄糖会产生有机酸，降低培养基氧化还原电位。
氯化钠：维持培养基的渗透压平衡，保证菌体正常形态。
2、厌氧环境构建原理
降低氧化还原电位：培养基中的L - 半胱氨酸盐酸盐是还原剂，可消耗培养基内的氧气，将氧化还原电位（Eh）降至厌氧菌生长所需的 -150 ~ -400mV；同时肝浸液中的还原性物质也可辅助维持低电位环境。
物理隔绝氧气：使用时通常在培养基液面覆盖一层无菌液体石蜡，隔绝空气与培养基的接触，防止氧气渗入，维持厌氧条件。
3、pH 缓冲体系
培养基中添加磷酸二氢钾、磷酸氢二钾作为缓冲对，稳定培养基 pH 在 7.2~7.6（厌氧菌最适生长 pH 范围），避免厌氧菌发酵产生的有机酸导致 pH 过度下降，抑制菌体生长。
二、配制与使用方法
（一）试剂配方（每 1000mL）
成分 用量
牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
肝浸液 200mL
葡萄糖 5.0g
氯化钠 5.0g
L - 半胱氨酸盐酸盐 0.5g
磷酸二氢钾 0.5g
磷酸氢二钾 0.5g
蒸馏水 800mL
液体石蜡（无菌） 适量
（二）配制步骤
溶解基础成分：将牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾加入 800mL 蒸馏水中，加热搅拌至完全溶解。
加入肝浸液：将 200mL 肝浸液加入上述溶液，补足蒸馏水至 1000mL，搅拌均匀。
调节 pH：用 1mol/L HCl 或 NaOH 调节 pH 至 7.2~7.6。
分装与加还原剂：按每管 10~15mL 分装于玻璃试管中，加入 L - 半胱氨酸盐酸盐（0.5g/L），拧紧试管盖（不要过紧，留少量缝隙）。
灭菌处理：采用121℃高压蒸汽灭菌 15min，灭菌后取出，待培养基冷却至 50℃左右时，在无菌条件下，每管加入1~2mL 无菌液体石蜡，覆盖液面，形成无氧隔离层。
保存：灭菌后的培养基置于 4℃冰箱保存，有效期为 1 个月，使用前需检查培养基是否澄清、有无浑浊或杂菌污染。
（三）使用方法
1、样本接种
无菌操作下，用接种环或无菌吸管吸取待检样本，穿刺接种至培养基深层（避免接种在液体石蜡层），轻微振荡混匀。
对于液体样本，可直接加入培养基中，样本与培养基比例约为 1:10。
2、培养条件
将接种后的培养基置于 35~37℃厌氧培养箱 中培养，或放入厌氧罐（配合厌氧产气袋）中培养。
培养时间根据厌氧菌种类调整：大多数厌氧菌培养 24~48h 可见明显生长；苛养厌氧菌需延长至 72h。
3、结果观察
培养后观察培养基是否出现浑浊、产气（试管内出现气泡）或沉淀。
若需进一步分离纯化，可吸取培养物，接种至厌氧血琼脂平板，进行划线分离，获得单菌落。
三、质量控制
无菌性检查：取 10% 的培养基样本，37℃培养 48h，无细菌生长则无菌性合格。
生长性能验证
氧化还原电位检测：使用氧化还原电位计测定，培养基电位应≤-150mV。
四、注意事项
肝浸液制备：肝浸液需新鲜制备，取新鲜牛肝或猪肝，剔除脂肪和结缔组织，绞碎后按 1:2 比例加蒸馏水，80℃水浴 1h，过滤后使用，可增强培养基营养。
还原剂添加：L - 半胱氨酸盐酸盐需在灭菌前加入，若灭菌后添加需经无菌过滤，避免高温分解失效。
接种操作：接种时避免刺破液体石蜡层，防止氧气进入培养基破坏厌氧环境；接种后及时拧紧试管盖。
污染处理：若培养基出现浑浊、变色或异味，表明已污染，需废弃。
五、常见问题及解决方案
常见问题 原因分析 解决方案
厌氧菌不生长或生长微弱 氧化还原电位过高；肝浸液营养不足 检查还原剂添加量，重新灭菌；更换新鲜肝浸液
培养基灭菌后浑浊 肝浸液未过滤彻底；灭菌温度过高 肝浸液经多层纱布过滤；严格控制灭菌参数
培养后出现杂菌污染 接种操作不无菌；液体石蜡未灭菌 加强无菌操作；液体石蜡单独 121℃灭菌 15min
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