微生物菌种传代操作指南之基本原则与规范及常用方法！
小杨 / 2026-03-19 10:12:34
一、基本原则与操作规范
为确保菌种的活性、纯度及遗传稳定性，所有操作必须严格遵守以下核心原则：
无菌操作：所有涉及菌种的操作，如转接、取样等，必须在符合要求的无菌环境（如已清洁消毒的超净工作台或生物安全柜）中进行。必须使用无菌的器具和耗材，并严格执行无菌操作技术，严防杂菌污染。
纯度确认：在菌种传代或长期保存前，必须对其纯度进行验证。常用的方法包括：观察平板或斜面上菌落的形态、颜色、边缘等特征是否均一；进行革兰氏染色或其他特异性染色后在显微镜下检查细胞形态是否一致。
标识清晰：所有培养容器（如平板、斜面、冻存管）都必须在显著位置粘贴唯一且清晰的标签。标签内容应至少包括：菌种名称、菌株编号、传代次数（代数）、接种/保存日期、所用培养基名称及推荐的保存条件。
生物安全：操作人员必须根据所处理菌种的生物危害等级，在相应等级的生物安全实验室中进行操作，并正确穿戴个人防护装备（如实验服、手套、护目镜等），确保实验安全。
二、菌株传代体系与代数管理
在实验室日常管理中，明确菌株的代次至关重要，它关系到实验结果的可靠性和可重复性。我们通常将菌株分为以下几个层级进行管理：
标准菌株（第0代）：指直接购自官方或国际认可的菌种保藏机构的冷冻干燥品或其他形式的标准培养物。这是所有后续工作的源头，其特性被严格定义。
标准储备菌株（第1代）：由第0代标准菌株复苏后，经第一次转接培养所获得的培养物（如菌悬液或斜面）。这是实验室制备的第一批活体储备。
储备菌株（第2代）：由第1代标准储备菌株转接后获得的培养物。它作为中期储备，用于制备日常使用的工作菌株。
工作菌株（第3-5代）：由第2代储备菌株转接获得，直接用于日常的微生物学实验、检验或生产。
关键管理原则：
单向传代原则：传代必须严格遵循从上一代到下一代的顺序，即只能由标准菌株制备储备菌株，由储备菌株制备工作菌株。工作菌株绝不可反向用作储备菌株。
代次限制：为确保实验结果的准确性，用于日常实验的工作菌株原则上不应超过第5代。除非有特定标准允许或实验室已验证菌株在更高代次下关键特性依然保持稳定，否则应避免使用超过第5代的菌株。
三、常见菌种保藏机构及其缩写
在订购或描述菌株来源时，需注明其保藏机构及编号，以确保菌株的可追溯性。常见机构缩写如下：
ATCC：美国典型培养物保藏中心
CMCC：中国医学细菌保藏管理中心
CGMCC：中国普通微生物菌种保藏管理中心
DSMZ：德国微生物和细胞培养物保藏中心
NCTC：英国国家典型培养物保藏中心
四、常用菌种传代方法
传代是将菌种接种至新鲜培养基上，以维持其活力并获得纯培养物的过程。以下是三种最常用的方法：
1、斜面传代法
适用范围：各类细菌、放线菌、酵母菌的短期保存和活力维持。
培养基：适合目标菌种生长的琼脂斜面培养基。
操作步骤：
准备：在酒精灯旁，准备已灭菌的新鲜斜面培养基和接种环。
取菌：将接种环在酒精灯火焰上烧红灭菌，待冷却后，从原菌种斜面上挑取少量菌苔。若原菌种为平板，应挑取形态典型的单个菌落。
接种：划线法适用于斜面，用接种环自斜面底部向上轻轻划一条“Z”字形连续曲线。穿刺法适用于半固体培养基，用接种针垂直刺入培养基中心部位。
培养：塞好管塞，置于设定好适宜温度的培养箱中培养，直至斜面表面长出丰满、典型的菌苔。
保存：培养好的斜面可暂时存放于2-8℃冰箱中。
2、液体培养基传代法
适用范围：需要大量菌体、观察生长特性或某些在液体环境中生长更佳的微生物。
培养基：适合目标菌种生长的液体培养基（如LB肉汤、营养肉汤、YPD培养基等）。
操作步骤：
使用无菌吸管、移液器或接种环，从新鲜培养的斜面或液体培养物（处于对数生长期）中吸取或挑取适量菌体。
将其接种至装有新鲜液体培养基的无菌容器（如试管、三角瓶）中。
根据菌种特性，选择适宜温度进行静置或振荡培养（需氧菌通常振荡以增加溶氧量），直至培养基明显浑浊（通常在对数生长后期停止）。
3、平板划线分离法
主要目的：主要用于从混合菌群中分离出单个菌落，是纯化菌种、检查菌种纯度最经典有效的方法。
操作步骤：通常采用四区划线法或三区划线法。在无菌条件下，用接种环蘸取少量菌悬液或菌苔，在固体琼脂平板表面有规律地分区划线。通过反复烧灼接种环，使菌液在平板上逐渐稀释，最终在最后的划线区域长出彼此分离的单个菌落。挑取单个菌落即可获得纯培养。
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