小鼠骨髓来源巨噬细胞的鉴定方法与分离培养及操作流程！_技术提供

小杨 / 2026-03-04 09:42:27

小鼠骨髓来源巨噬细胞（Bone Marrow-derived Macrophages, BMDMs）的核心知识，包括定义、分离培养流程、鉴定方法、极化调控、应用及关键注意事项，方便直接用于实验设计与操作。

一、基础定义与生物学特性

本质：由小鼠骨髓造血前体/单核祖细胞，在体外经M-CSF（巨噬细胞集落刺激因子，常用重组蛋白或 L929 条件培养基提供）诱导分化而来的原代巨噬细胞；并非直接从组织分离的成熟巨噬，是免疫研究的标准体外模型。

形态：分化过程中由圆形悬浮→贴壁→扁平、多角形，有明显伪足；成熟后贴壁紧密，具强吞噬活性。

表型：成熟 M0 静息型高表达F4/80⁺CD11b⁺，伴随 CD68、CD14 等；可被 IFN-γ+LPS 极化为M1 促炎型（高表达 CD86、MHC-Ⅱ），或被 IL-4/IL-13 极化为M2 抗炎/修复型（高表达 CD206、Arg1）。

优势：来源均一、数量充足、遗传背景可控（适合基因敲除小鼠）、可塑性强，纯度通常可达 90%+。

二、标准分离与分化培养步骤（无菌冰上操作）

小鼠处死与骨骼分离：颈椎脱臼处死，70% 乙醇全身浸泡；分离双侧股骨、胫骨，剔除肌肉，剪断骨骺端。

骨髓冲洗与红细胞去除：用含双抗的冷 PBS /无血清 DMEM 通过 23G 针头冲洗骨髓至离心管；70 μm 滤网过滤；ACK 裂解液处理 5 min 去除红细胞，PBS 洗涤 2 次。

接种与诱导：用含 10% 优质 FBS、1% 双抗、30–50 ng/mL 重组 M-CSF（或 20% L929 条件培养基）的高糖 DMEM 重悬；按 2–5×10⁵ cells/cm² 接种；37℃、5% CO₂培养。

换液与成熟：第 3 天半量/全量换新鲜含 M-CSF 的培养基；第 6–7 天分化为成熟 M0 巨噬细胞；如需收集，用冰冷 PBS 洗 2 次，细胞刮/ EDTA（避免胰酶过度消化）收集。

长期保藏：20% 甘油 + 培养基，-80℃梯度降温后液氮冻存。

三、鉴定与质控方法

流式细胞术：CD11b⁺F4/80⁺双阳性率 > 90% 为合格；M1/M2 分别检测 CD86/MHC-Ⅱ、CD206/Arg1。

形态学：光镜观察贴壁、多角形、伪足；荧光标记 F-actin 显示细胞骨架。

功能检测：中性红/乳胶珠吞噬实验测吞噬能力；ELISA/qPCR 检测 LPS 刺激后 TNF-α、IL-6 等炎症因子分泌。

无菌与支原体检测：培养基无菌浑浊，PCR 法排查支原体。

四、常见问题与解决方案

问题原因对策

细胞不贴壁、大量死亡 FBS 批次差、M-CSF 浓度不足、污染、温度 pH 异常筛选胎牛血清；保证 M-CSF 30–50 ng/mL；严格无菌操作；校准培养箱参数

分化纯度低骨髓前体污染、诱导时间不足延长培养至 7 天；用流式分选 CD11b⁺F4/80⁺细胞

细胞活化不均培养基含内毒素、操作损伤使用无内毒素 FBS /培养基；轻柔操作，避免反复吹打

五、应用领域

免疫与炎症：病原体识别、炎症小体激活、巨噬细胞极化机制研究；

疾病模型：代谢性疾病（肥胖、脂肪肝）、肿瘤免疫、自身免疫病、感染性疾病；

药物筛选：抗炎、免疫调节、抗巨噬细胞相关疾病的化合物评价；

基因功能：CRISPR/Cas9 基因编辑 BMDM，研究巨噬细胞相关基因功能。

六、极化诱导方案（可选）

M1：100 ng/mL LPS + 20 ng/mL IFN-γ，刺激 24 h；

M2a：20 ng/mL IL-4，刺激 24–48 h；

M2c：20 ng/mL IL-10，刺激 24 h。

北京百欧博伟生物技术有限公司的微生物菌种查询网提供微生物菌种保藏、测序、购买等服务,是中国微生物菌种保藏中心的服务平台，并且是集微生物菌种、菌种,ATCC菌种、细胞、培养基为一体的大型微生物查询类网站，自设设备及技术的微生物菌种保藏中心！欢迎广大客户来询！

热度推荐