嗜冷菌计数琼脂（乳平板计数琼脂）的原理与使用方法！
小杨 / 2026-01-12 09:57:08
嗜冷菌计数琼脂是专门用于乳制品中嗜冷菌计数的选择性培养基，这类菌株可在低温（7~10℃）下生长繁殖，分解乳中蛋白质和脂肪导致乳品变质，该培养基通过营养供给和温度筛选实现目标菌的定量计数。
一、培养基原理
1、核心营养成分
培养基以胰蛋白胨、大豆蛋白胨为氮源，提供细菌生长所需的氨基酸、多肽；以乳糖为主要碳源，适配乳源微生物的代谢特性；添加磷酸二氢钾、硫酸镁维持渗透压和 pH 稳定，琼脂作为凝固剂形成固体平板。
2、选择性筛选机制
嗜冷菌的最适生长温度为 10~20℃，在 6.5~7.0℃ 的低温条件下仍可生长，而大多数中温菌（如
大肠杆菌、
葡萄球菌）在此温度下生长受抑制。
该培养基不添加额外抑菌剂，通过低温培养条件实现对嗜冷菌的选择性计数，菌落生长后直接统计平板上的菌落数（CFU），换算成每克/毫升样品中的嗜冷菌数量。
二、使用方法（适用于乳制品检测，遵循 GB 4789.18-2010 等标准）
1、培养基制备（干粉剂型，按说明书配比）
操作步骤 实践细节 质量控制要点
称量溶解 取规定量干粉（如 23.5g/1000mL），加入蒸馏水或去离子水，搅拌均匀 避免干粉结块，可加热助溶
灭菌处理 121℃高压蒸汽灭菌 15min 灭菌后 pH 应为 6.8±0.2，若偏差需用 1mol/L HCl/NaOH 调整
倒平板 待培养基冷却至 45~50℃时，无菌操作倾注到无菌培养皿中，每皿 15~20mL，凝固后备用 平板厚度均匀，无气泡、无污染；制备好的平板 4℃避光保存，3 天内使用
2、样品处理（以液态奶、奶粉为例）
液态奶：无菌操作吸取 25mL 样品，加入 225mL 无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液（PBS）中，充分摇匀，制成 1:10 的稀释液。
奶粉：称取 25g 样品，加入 225mL 无菌稀释液，震荡溶解，制成 1:10 稀释液。
梯度稀释：根据样品污染程度，将 1:10 稀释液进一步做 10 倍系列稀释（如 10⁻²、10⁻³、10⁻⁴），选择 3 个适宜稀释度进行接种。
3、接种与培养
涂布接种：无菌操作吸取每个稀释度的稀释液 0.1mL，滴加到嗜冷菌计数琼脂平板中央，用无菌玻璃刮铲均匀涂布。
或采用倾注法：吸取 1mL 稀释液加入无菌培养皿，再倒入冷却至 45℃的培养基，摇匀凝固。
阴性对照：同时设置空白对照（仅接种无菌稀释液），验证培养基和操作过程是否污染。
低温培养：将接种后的平板倒置，放入 6.5℃±0.5℃ 的恒温培养箱中，培养 10 天 ±2h。
注意：培养期间需保持温度稳定，避免温度波动影响嗜冷菌生长。
4、菌落计数与结果计算
菌落筛选：选择菌落数在 25~250CFU 之间的平板进行计数，若稀释度适宜，同一稀释度的两个平行平板菌落数差值应≤10%。
结果换算
涂布法：嗜冷菌数（CFU/g 或 mL）= 平板菌落数 × 稀释倍数 × 10
倾注法：嗜冷菌数（CFU/g 或 mL）= 平板菌落数 × 稀释倍数
报告规则：若所有稀释度平板菌落数均＜25，以最低稀释度的菌落数计算；若均＞250，以最高稀释度的菌落数计算；若空白对照出现菌落，实验无效，需重新检测。
三、注意事项
培养基灭菌时温度不可过高、时间不可过长，否则会导致营养成分破坏、pH 下降，影响细菌生长。
样品稀释和接种过程需严格无菌操作，防止杂菌污染，尤其注意低温操作时的环境无菌性。
培养温度是关键因素，需使用精度高的低温培养箱，定期校准温度；培养时间不足会导致菌落计数偏低。
该培养基主要用于乳制品中嗜冷菌计数，若用于其他样品，需验证培养基的适用性。
四、常见问题排查
平板无菌落生长：可能原因是培养基灭菌过度、培养温度偏离、样品稀释度过高；排查方法为检查培养箱温度、重做稀释实验、验证培养基质量。
菌落形态异常：可能是样品中含大量产黏液菌株，可适当提高稀释度，或采用涂布法减少菌落蔓延。
平行平板菌落数差异大：可能是接种时稀释液涂布不均、样品未充分混匀；需优化接种操作，确保样品稀释液摇匀后再接种。
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