大鼠关节滑膜成纤维细胞原代培养与传代培养标准方法！
小杨 / 2026-01-12 09:21:20
一、实验准备
1、试剂与耗材
基础培养基：DMEM 或 RPMI-1640（低糖型更适合成纤维细胞增殖）
完全培养基：基础培养基 + 10% 胎牛血清（FBS，需热灭活） + 1% 青霉素 - 链霉素双抗（终浓度 100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素）
消化液：0.25% 胰蛋白酶 - 0.02% EDTA 混合液
缓冲液：无菌 PBS（不含钙镁离子）
其他试剂：75% 医用酒精、无菌生理盐水、台盼蓝染色液
耗材：无菌手术器械（眼科剪、眼科镊、止血钳）、6 孔/ 12 孔细胞培养板、离心管、移液管、超净工作台、CO₂培养箱
2、实验动物
选取 4~6 周龄 SD 或 Wistar 大鼠（体重 150~200 g），雌雄不限，SPF 级饲养，减少微生物污染风险。
二、原代分离培养（组织块贴壁法/酶消化法，推荐组织块贴壁法，细胞活性更高）
方法 1：组织块贴壁法（首选）
动物消毒与取材
大鼠脱颈处死，75% 酒精浸泡全身 5 min 消毒，转入超净工作台。
无菌操作剪开膝关节皮肤与肌肉，暴露关节囊，用止血钳夹住关节囊边缘，剥离完整滑膜组织（呈淡红色、半透明薄膜状）。
用无菌 PBS 反复冲洗滑膜组织 3~5 次，去除残留血液、脂肪和软骨碎屑。
组织块剪碎与接种
将洗净的滑膜组织置于无菌培养皿中，用眼科剪剪切成 1 mm³ 左右的微小组织块。
用移液管将组织块均匀接种于 6 孔培养板底部，每孔接种 8~10 块，轻轻按压组织块使其紧贴孔底（避免悬浮）。
静置培养板 2~4 h，使组织块初步贴壁。
加液与培养
沿培养板孔壁缓慢加入 1.5~2 mL 完全培养基，避免冲脱组织块，做好标记。
将培养板放入 37℃、5% CO₂ 饱和湿度培养箱中培养。
换液：前 3 天不换液，减少组织块脱落；第 3 天首次换液，吸弃旧培养基，加入新鲜完全培养基；之后每 2~3 天换液 1 次。
细胞爬出观察
培养 5~7 天后，在倒置显微镜下可见梭形细胞从组织块边缘爬出，呈放射状或漩涡状生长；培养 10~14 天，细胞可增殖至 80%~90% 汇合度，即可进行传代。
方法 2：酶消化法（适用于需要快速获得大量细胞的场景）
取材与冲洗步骤同组织块贴壁法，将滑膜组织剪碎至 1 mm³ 大小。
加入 3~5 倍体积的 0.25% 胰蛋白酶 - EDTA 消化液，37℃ 恒温摇床消化 30~40 min，期间每隔 10 min 轻轻震荡 1 次。
加入等体积完全培养基终止消化，用 200 目无菌细胞筛网过滤，去除未消化的组织碎片。
滤液转入离心管，1000 r/min 离心 5 min，弃上清；用完全培养基重悬细胞沉淀，调整细胞密度至 1×10⁶ 个 /mL。
接种于培养板，37℃、5% CO₂ 培养，24 h 后首次换液，去除未贴壁细胞，后续每 2~3 天换液 1 次，细胞汇合度达 80% 后传代。
三、传代培养
预处理：吸弃培养板中的旧培养基，用无菌 PBS 冲洗细胞层 2 次，去除残留血清（血清会抑制胰蛋白酶活性）。
消化：每孔加入 0.5~1 mL 0.25% 胰蛋白酶 - EDTA 消化液，覆盖细胞层，37℃ 孵育 1~2 min；倒置显微镜下观察，当细胞形态变圆、细胞间隙增大时，立即加入完全培养基终止消化。
吹打与离心：用移液管轻轻吹打细胞层，使细胞完全脱落，形成单细胞悬液；将悬液转入离心管，1000 r/min 离心 5 min，弃上清。
重悬与接种：用完全培养基重悬细胞沉淀，调整细胞密度至 5×10⁵ 个 /mL，按 1:2 的比例接种于新的培养板（RSyF 传代比例不宜过高，否则影响增殖）。
培养：接种后放入培养箱，24 h 后换液，后续每 2~3 天换液 1 次，细胞汇合度达 80% 时可再次传代或用于后续实验。
四、冻存与复苏（可选，用于长期保存细胞）
1、冻存
选择对数生长期的细胞，按传代步骤消化、离心，弃上清。
用冻存液（90% FBS + 10% DMSO）重悬细胞，调整密度至 1×10⁷ 个 /mL，转入冻存管。
程序降温：4℃ 放置 30 min → -20℃ 放置 1 h → -80℃ 过夜 → 次日转入液氮罐长期保存。
2、复苏
从液氮罐取出冻存管，迅速放入 37℃ 水浴锅，快速摇晃 1~2 min 至完全融化。
用移液管将细胞悬液转入离心管，加入 5 倍体积完全培养基，1000 r/min 离心 5 min，弃上清（去除 DMSO，减少细胞毒性）。
完全培养基重悬细胞，接种于培养板，24 h 后换液，去除死亡细胞。
五、质量控制与鉴定
形态学鉴定：倒置显微镜下观察，RSyF 呈典型长梭形，贴壁生长，排列呈漩涡状或平行状，无明显上皮样细胞混杂。
免疫表型鉴定：采用免疫荧光或流式细胞术检测，波形蛋白阳性（成纤维细胞标志物），CD68 阴性（巨噬细胞标志物，排除 A 型滑膜细胞污染），细胞纯度应 ≥ 90%。
活力检测：台盼蓝染色，活细胞拒染，细胞活力应 ≥ 90%。
六、常见问题及解决方案
常见问题 原因分析 解决方案
组织块脱落，无细胞爬出 组织块未贴紧孔底；培养基加入过快冲脱组织块 接种后静置 4~6 h 再加液；加液时沿孔壁缓慢滴加
细胞污染（细菌/真菌） 手术器械消毒不彻底；动物体表消毒不充分；培养基污染 严格无菌操作；手术器械高压灭菌；75% 酒精浸泡动物时间不少于 5 min；培养基使用前检测
细胞增殖缓慢，形态不规则 血清质量差；传代次数过多；培养温度/CO₂ 浓度异常 更换优质胎牛血清；使用 3~5 代以内的细胞；校准培养箱参数（37℃、5% CO₂）
细胞混杂上皮样细胞 取材时混入软骨或滑膜上皮组织 取材时尽量剥离纯净滑膜组织；用 200 目筛网过滤细胞悬液
七、注意事项
原代培养的关键是无菌操作和组织块贴壁，操作过程中避免反复晃动培养板。
胰蛋白酶消化时间不宜过长，否则会损伤细胞膜，导致细胞死亡。
RSyF 传代超过 5 代后易出现老化，表现为细胞空泡增多、增殖停滞，建议实验使用 3~5 代的细胞。
DMSO 具有细胞毒性，复苏时需彻底离心去除，且冻存液需现配现用。
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