乳酸杆菌琼脂培养基的通用制备方法及关键注意事项！
小杨 / 2025-11-21 09:25:43
一、核心制备步骤（以 1L 培养基为例）
1、原料称量（精准度直接影响培养效果）
根据目标培养基配方（参考之前提到的 MRS、LBS 等），用电子天平称量所有成分，例如 MRS 琼脂（1L）：
蛋白胨 10.0g、牛肉浸粉 8.0g、酵母浸粉 4.0g
葡萄糖 20.0g、磷酸氢二钾 2.0g、柠檬酸氢二铵 2.0g
乙酸钠 5.0g、硫酸镁 0.2g、硫酸锰 0.04g
吐温 - 80 1.0mL（液体成分，直接量取）、琼脂 14.0g
2、溶解与搅拌（确保无沉淀，成分均匀）
将称量好的固体原料全部放入 1L 烧杯中，加入约 900mL 去离子水（或蒸馏水，避免杂质影响）。
置于磁力搅拌器上，低速搅拌，同时用酒精灯小火加热（或隔水加热），直至琼脂完全融化、所有成分溶解（溶液呈透明状，无颗粒或沉淀）。
加热时需不断搅拌，防止琼脂粘锅烧焦；避免煮沸过度（高温可能破坏营养成分，如酵母浸粉中的维生素）。
3、补加水与调节 pH 值（关键步骤，适配乳酸杆菌酸性生长环境）
培养基冷却至 40-50℃（不烫手）后，补充去离子水至 1000mL（加热过程中水分会蒸发，需补至设定体积）。
用 pH 计测量 pH 值，根据配方要求调节（多数乳酸杆菌培养基 pH 为 5.5-6.8，如 LBS 为 5.5±0.2，MRS 为 6.5±0.2）：
pH 偏高：滴加 1mol/L 盐酸溶液，边滴加边搅拌，直至达标；
pH 偏低：滴加 1mol/L 氢氧化钠溶液，同理调节。
调节后需再次搅拌均匀，重新测量 pH，确保误差在 ±0.2 内。
4、分装与灭菌（无菌是核心，避免杂菌污染）
将调节好的培养基分装至锥形瓶中（分装量不超过锥形瓶容积的 1/2，预留灭菌时的膨胀空间），瓶口用双层纱布 + 牛皮纸包扎（或用无菌硅胶塞密封）。
采用高压蒸汽灭菌法：121℃、103.4kPa（1.05kg/cm²），灭菌 15-20 分钟（杀灭所有微生物，包括芽孢）。
注意：灭菌时间过长会破坏营养成分，过短则灭菌不彻底；灭菌后自然排气，避免压力骤降导致培养基暴沸。
5、冷却与倒平板（避免凝固或污染）
灭菌后的培养基取出，在超净工作台内冷却至 50-60℃（手感不烫手，避免温度过高杀死后续接种的菌种，或过低导致琼脂凝固无法倒板）。
若需添加抗生素等选择性成分（如抑制杂菌的万古霉素），需在培养基冷却至 50℃左右时加入（高温会破坏抗生素活性），快速搅拌均匀。
打开培养皿（无菌操作，避免手接触皿盖内侧和皿底），将培养基倒入培养皿中，每皿约 15-20mL（厚度均匀，覆盖皿底即可）。
倒完后，水平放置培养皿，待培养基自然凝固（约 30 分钟，避免晃动导致表面不平整）。
6、无菌检验与保存（确保培养基可用）
凝固后的平板，倒置放入 37℃恒温培养箱中，空白培养 24-48 小时（检测是否灭菌彻底，若平板上无杂菌菌落，则合格）。
合格的平板可密封后，4℃冷藏保存（避免阳光直射），1 周内使用完毕（存放过久会导致水分流失、营养成分降解）。
二、关键注意事项
原料质量：乳酸杆菌对营养要求高，需使用优质蛋白胨、酵母浸粉（避免过期或变质原料）；葡萄糖需用无水葡萄糖，避免结块。
无菌操作：从分装、灭菌后开盖到倒平板，全程在超净工作台内进行，操作时戴无菌手套、口罩，避免空气中杂菌污染。
琼脂融化：必须确保琼脂完全融化，否则凝固后会有硬块，影响平板平整度和菌种生长。
pH 适配性：乳酸杆菌为兼性厌氧菌，偏好酸性环境，pH 过高会抑制生长，过低可能导致菌种死亡，需严格按配方调节。
特殊添加物：若用于选择性分离（如
LBS 琼脂），无需额外添加抑制剂（配方中已含乙酸钠等抑菌成分）；若需强化分离，可在冷却后添加 0.05g/L 万古霉素（抑制革兰氏阳性杂菌）。
三、常见问题排查
平板凝固后表面有水珠：倒板后未倒置冷却，或培养箱湿度太高，可倒置于 37℃烘干 1-2 小时再使用。
菌种不生长：可能是 pH 调节不当、灭菌时营养成分破坏（如加热过度），或原料过期，需逐一排查。
杂菌污染严重：灭菌不彻底或操作过程污染，需重新灭菌，严格无菌操作。
北京百欧博伟生物技术有限公司拥有对菌种、细胞、培养基、配套试剂等产品需求者的极优质服务，对购买项目的前期资料提供,中期合同保证,后期货物跟踪到最终售后的确保项目准确到位，都有相关人士进行维护,确保您在
微生物菌种查询网中获得最优质服务！也正因为此，北京百欧博伟生物技术有限公司与国内外多家研制单位、生物制药、第三方检测机构和科研院所院校、化工企业有着良好、长期和稳定的合作关系！
下载附件
上一篇：实验室制备基础培养基的材料准备与具体步骤及注意事项！
下一篇：细菌生长曲线制作攻略：取样、测OD、绘图三步轻松搞定！