克氏双糖铁琼脂的实验室标准制备方法及关键注意事项！
小杨 / 2025-08-29 09:16:36
克氏双糖铁琼脂（KIA）的制备需严格控制成分比例、pH 值、灭菌条件及斜面成型工艺，以确保其鉴别功能的准确性（如糖发酵反应、H₂S 检测的灵敏度）。以下是实验室标准制备方法，涵盖“试剂准备 - 配制 - 灭菌 - 分装 - 成型”全流程，适用于批量或少量制备。
一、制备前核心准备
1、关键试剂与规格
KIA 的成分需精准称量，尤其是葡萄糖（低浓度）与乳糖（高浓度）的比例（1:10），直接影响糖发酵结果判读；H₂S 检测相关成分需避免氧化，建议使用新鲜试剂。具体试剂及用量（以制备 1000mL 培养基为例）如下表：
试剂名称 化学纯（CP）或生物试剂（BR） 用量（1000mL） 核心作用
牛肉膏 BR 3g 提供氮源、维生素、生长因子，促进细菌生长
蛋白胨 BR（胰蛋白胨或大豆蛋白胨） 20g 主要氮源，提供氨基酸，支持细菌代谢
葡萄糖 BR（无水） 1g 低浓度碳源，检测细菌对单糖的发酵能力
乳糖 BR（无水） 10g 高浓度碳源，检测细菌对双糖的发酵能力（与葡萄糖形成浓度差）
硫酸亚铁铵 CP 0.2g 提供 Fe²⁺，与 S²⁻结合生成黑色 FeS 沉淀，检测 H₂S
硫代硫酸钠 CP（无水） 0.3g 提供 S²⁻前体，被细菌分解为 S²⁻，作为 H₂S 的底物
酚红指示剂 0.2% 水溶液（BR） 12.5mL pH 指示剂（pH 6.8-8.4：黄→红），可视化糖发酵产酸导致的 pH 变化
琼脂 BR（细菌培养专用） 15-20g 凝固剂，形成固体培养基（浓度需适中：过低易液化，过高过硬影响穿刺）
蒸馏水 无离子水或双蒸水 1000mL 溶剂，避免杂质（如金属离子）干扰 H₂S 反应
2、仪器与耗材
称量工具：电子天平（精度 0.01g）、药匙（专用，避免交叉污染）；
溶解容器：2000mL 锥形瓶（带刻度，便于定容）；
灭菌设备：高压蒸汽灭菌锅（需校准温度与压力）；
分装工具：15mm×150mm 玻璃试管（或一次性无菌试管）、移液管（10mL/25mL）；
辅助工具：pH 计（或精密 pH 试纸，范围 6.0-8.0）、酒精灯、石棉网、磁力搅拌器（可选，加速溶解）、斜面架（或试管架，用于成型）。
3、预操作：试剂预处理
硫酸亚铁铵易氧化（氧化后 Fe²⁺变为 Fe³⁺，影响 H₂S 检测），需在临溶解前称量，且避免长时间暴露于空气中；
酚红指示剂若有沉淀，需过滤后使用（0.22μm 滤膜过滤），防止指示剂颗粒影响观察；
琼脂需掰成小块（或粉末状），避免溶解时结块（结块会导致灭菌不彻底）。
二、分步制备流程（1000mL 为例）
步骤 1：称量与溶解（核心：先溶解可溶性成分，后加琼脂）
溶解基础营养成分：向 2000mL 锥形瓶中加入 800mL 蒸馏水，依次加入牛肉膏、蛋白胨，用玻璃棒搅拌至完全溶解（可置于石棉网上小火加热，加速溶解，避免糊底）；
加入糖与 H₂S 相关试剂：待上述溶液冷却至 50℃以下（避免高温破坏葡萄糖），加入葡萄糖、乳糖、硫酸亚铁铵、硫代硫酸钠，继续搅拌至完全溶解（此阶段溶液应呈淡黄色透明状，无沉淀）；
定容与调节 pH：向锥形瓶中补加蒸馏水至 1000mL 刻度线，用 pH 计检测当前 pH 值（未加琼脂和指示剂时），需调节至7.4±0.2（若 pH 偏低，滴加 1mol/L NaOH 溶液；若 pH 偏高，滴加 1mol/L HCl 溶液，边加边搅拌，避免 pH 骤变）；
加入琼脂与指示剂：加入称量好的琼脂，搅拌均匀后，滴加 0.2% 酚红指示剂 12.5mL，继续搅拌至溶液呈均匀淡红色（此时溶液可能因琼脂未溶解而浑浊，属正常现象）。
步骤 2：灭菌（关键：防止糖碳化与成分分解）
KIA 含葡萄糖、乳糖等易碳化成分，需采用“低压蒸汽灭菌”，避免高温导致糖分解或颜色变深（影响结果判读），具体参数如下：
灭菌设备：高压蒸汽灭菌锅（立式或卧式）；
灭菌条件：121℃、103.4kPa（1.05kg/cm²），灭菌 15 分钟（灭菌时间过长会导致琼脂软化，过短则灭菌不彻底，易污染）；
灭菌后处理：灭菌结束后，立即关闭加热，待灭菌锅内压力降至 0kPa、温度降至 100℃以下时，缓慢打开排气阀，取出锥形瓶（避免骤冷导致溶液暴沸），置于 50-60℃水浴锅中保温（防止琼脂凝固，便于后续分装）。
步骤 3：分装（核心：控制装量，确保“斜面 + 底层”比例）
KIA 需制成“底层高、斜面短”的柱状形态（底层为厌氧环境，斜面为有氧环境），分装时需注意：
试管准备：将 15mm×150mm 玻璃试管洗净、烘干，置于试管架上（每管装量约 10-12mL，可装 80-100 管 / 1000mL）；
分装操作：用无菌移液管（或直接倾倒，倾倒时需在酒精灯火焰旁，避免污染）向试管内加入培养基，每管液面高度约为试管长度的 1/3（即 4-5cm，确保底层厚度足够，穿刺时能达厌氧环境）；
避免污染：分装过程中，锥形瓶瓶口始终靠近酒精灯火焰，试管口倾斜 45°，防止空气中的杂菌落入。
步骤 4：斜面成型（决定有氧 / 厌氧环境的关键）
分装后需立即制作斜面，确保琼脂凝固后形成“底层直立、斜面平缓”的结构：
放置试管：将分装好的试管斜置于斜面架上，调节斜面角度，使试管底部（底层）高度约为斜面顶端高度的 2 倍（即斜面长度约为试管长度的 1/2，避免斜面过长导致底层过薄，或斜面过短影响有氧生长）；
凝固条件：置于室温（25-30℃） 自然凝固（约 2-3 小时），或置于 4℃冰箱加速凝固（1 小时，需加盖防尘罩，避免吸潮）；
禁止在高温环境下凝固（如靠近暖气或烘箱），否则会导致水分蒸发过多，琼脂干裂，影响细菌生长；
检查成型质量：凝固后，斜面应平整、无气泡、无裂痕，底层无分层，整体颜色为均匀淡红色（若颜色偏深或偏黄，可能是 pH 异常或灭菌过度，需丢弃）。
步骤 5：灭菌后验证与储存
无菌性验证：随机抽取 3-5 管制备好的 KIA，置于 37℃恒温培养箱中培养 24 小时，若培养基表面无杂菌生长（无霉斑、浑浊、菌落），则无菌性合格；若有污染，需整批重新制备；
大肠埃希菌应呈“A/A，产气 ±，H₂S-”；
沙门氏菌应呈“K/A，产气 +，H₂S+”；
若结果符合预期，说明培养基性能合格；
储存条件：合格的 KIA 需密封（试管口用 parafilm 缠绕，或放入密封袋），置于 4℃冰箱储存，有效期为1 个月（储存过久易吸潮，导致琼脂软化或成分降解，影响结果）；使用前需提前 1 小时取出，恢复至室温。
三、制备关键注意事项（避免结果误差）
pH 值精准控制：最终培养基 pH 必须为 7.4±0.2（未灭菌前调节），若 pH 偏低（<7.2），未接种时可能已呈黄色，导致误判；若 pH 偏高（>7.6），糖发酵产酸后可能无法使指示剂变黄，掩盖阳性反应；
硫酸亚铁铵与硫代硫酸钠的添加顺序：需在基础营养成分溶解后、琼脂加入前添加，避免与高温琼脂直接接触（高温可能导致 Fe²⁺氧化，降低 H₂S 检测灵敏度）；
灭菌时间与温度：严格遵循 121℃、15 分钟，不可延长灭菌时间（如 20 分钟），否则葡萄糖、乳糖会碳化（溶液呈褐色），影响颜色观察；
斜面成型角度：斜面长度不可超过试管长度的 1/2，否则底层厚度不足（<3cm），穿刺时无法达到厌氧环境，导致底层反应（如产气、H₂S）不明显；
避免反复加热：灭菌后的培养基若未及时分装凝固，可在 50-60℃水浴中保温 1-2 小时，但不可反复加热（超过 2 次），否则琼脂会降解（失去凝固能力），且成分会破坏。
通过以上标准化制备流程，可确保
KIA 的物理性状（凝固度、颜色）和生化性能（糖发酵、H₂S 检测）符合要求，为肠杆菌科细菌的鉴别提供可靠的培养基基础。
北京百欧博伟生物技术有限公司拥有对菌种、细胞、培养基、配套试剂等产品需求者的极优质服务，对购买项目的前期资料提供,中期合同保证,后期货物跟踪到最终售后的确保项目准确到位，都有相关人士进行维护,确保您在
微生物菌种查询网中获得最优质服务！也正因为此，北京百欧博伟生物技术有限公司与国内外多家研制单位、生物制药、第三方检测机构和科研院所院校、化工企业有着良好、长期和稳定的合作关系！
下载附件
上一篇：微生物纯培养操作技术详解之倒平板、划平板与涂布！
下一篇：鞭毛染色法的操作流程与应用场景及常见问题与解决方案！