微生物纯培养操作技术详解之倒平板、划平板与涂布！
小杨 / 2025-08-28 09:48:21
百欧博伟生物：微生物纯培养中的三项基本操作：倒平板、划平板和涂布。这三项技术是微生物学实验的基石，用于分离、纯化和获得单个菌落。
一、倒平板
这是准备工作，指将融化并冷却至一定温度的固体培养基倒入无菌培养皿中，使其凝固形成均匀平板的过程。
目的：制备无菌的、表面光滑平整的固体培养基平板，为后续的接种、分离和培养提供支持。
关键步骤：
融化培养基：将配制好的固体培养基（通常装在三角瓶或试管中）加热融化。
冷却：将其冷却至45-50℃（用手触摸三角瓶，感觉烫手但能握住几秒钟为宜）。这是最关键的一步，温度过高会产生大量冷凝水并烫死微生物；温度过低则培养基会提前凝固，无法倒出平整的平板。
倒皿：在酒精灯火焰附近的无菌区域，打开培养皿盖一条小缝，迅速倒入约15-20mL培养基（使皿底厚度约3-4mm）。
凝固：轻轻水平晃动培养皿，使培养基均匀铺满皿底，然后静置在水平桌面上，待其完全凝固。
预处理：倒置平板，放入37℃恒温箱中孵育过夜，检查是否有杂菌污染并蒸发掉多余冷凝水。确认无菌后方可使用。
注意事项：
无菌操作：整个过程应在酒精灯火焰附近进行，防止空气中的杂菌落入。
温度控制：冷却必须到位。
厚度均匀：晃动要轻，确保平板厚度一致。
二、划平板
又称“平板划线法”或“划线分离法”，是一种用接种环对微生物样品进行机械稀释的方法。
目的：将混杂在一起的微生物样品在平板表面通过划线的方式分散开来，最终在末次划线区域形成单个孤立的菌落，以达到分离纯种的目的。
关键步骤（以最常用的“四分法”或“三段划线法”为例）：
接种环灭菌：接种环在酒精灯外焰上烧红灭菌，冷却。
取菌：用冷却的接种环沾取少量菌液或挑取单个菌落。
划线：
第一区：在平板培养基的一侧，连续划几条密集的、不重叠的“之”字形或平行线（约占平板面积的1/4）。此区域菌量最多。
灭菌：烧红接种环，冷却（关键！）。
第二区：将接种环从第一区末端延伸出的菌落上划过1-2次，然后在新区域（与第一区有少量重叠）划出另一组线，约占另一个1/4。此时，接种环上携带的菌量已减少。
再次灭菌：重复灭菌接种环。
第三、四区：重复以上过程，从上一区的末端划过，在新的空白区域划线。每划一个新区，菌量就被稀释一次。
培养：划线完成后，盖上皿盖，将平板倒置（防止冷凝水滴落冲散菌落），放入恒温培养箱中培养。
注意事项：
彻底灭菌：每次划新区前，接种环必须彻底灭菌冷却，否则无法起到稀释作用。
勿划破培养基：用力要轻，避免划破琼脂表面。
区域分明：各区线之间尽量不重叠，以保证稀释效果。
三、涂布
又称“涂布平板法”，需要先将一定量的菌液加到平板中央，然后用一个无菌的涂布棒将其均匀地涂布到整个平板表面。
目的：
分离纯化：与划线法类似，通过将菌液均匀分散来获得单菌落。
定量计数：这是涂布法更重要的用途。由于加入的菌液体积是已知的（如100μL），长出的菌落数可以用来推算原始菌液中的微生物浓度（CFU/mL，菌落形成单位/毫升）。
关键步骤：
加样：用无菌移液器吸取一定体积（通常为0.1-0.2mL）的菌液（或经过适当稀释的菌液）滴加在平板培养基中央。
涂布：手持无菌的玻璃涂布棒（L型棒），将其一端轻轻接触培养基表面使其冷却。然后将涂布棒垂直贴在平板表面，快速而平稳地旋转平板，将菌液均匀地涂开，直至菌液被培养基完全吸收。
吸收：静置片刻，让菌液完全渗入培养基。
培养：倒置平板，进行培养。
注意事项：
涂布棒无菌：涂布棒使用前必须用酒精浸泡并在火焰上灼烧灭菌，切记要冷却，否则会烫死微生物。
菌液量适中：加入的菌液不宜过多，否则不易涂开且不易吸收，会导致菌落连成一片。
涂布均匀：要确保菌液被涂布到整个平板表面，这样才能长出均匀分布的菌落以便计数。
总结与对比
特性 倒平板 划平板 涂布
主要目的 制备无菌平板 分离纯化微生物 分离纯化和定量计数
操作核心 倾倒培养基 用接种环划线稀释 用涂布棒涂布均匀
关键工具 三角瓶、培养皿 接种环 移液器、涂布棒
对氧需求 适用于兼性厌氧菌和需氧菌 特别适用于需氧菌（所有细胞都在表面）
菌落位置 主要在表面生长 完全在表面生长
优点 基础准备工作 快速、简便、无需特殊设备 定量、菌落分布均匀
缺点 无法用于精确计数 需要额外工具（移液器、涂布棒），操作稍繁琐
简单来说：
倒平板是“做盘子”。
划平板和涂布是“分菜”的方法，目的都是把一盘混合的“菜”（微生物混合物）分装开，让每种“菜”（纯种微生物）都能独立成盘（形成单菌落）。划平板像用筷子拨拉，涂布像用铲子摊平，后者还能数清楚一开始下了多少“料”（定量计数）。
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