流式细胞术的实验原理与技术特点及核心应用领域！_技术提供

小杨 / 2025-04-12 09:39:32

流式细胞术（Flow Cytometry）是一种通过检测悬浮细胞或微粒的物理和化学特性，进行快速、多参数定量分析的技术。其核心原理基于细胞在液流中单列通过检测区时，与激光相互作用产生的光信号，结合荧光标记技术对细胞进行识别和分析。以下是其详细实验原理：

一、样本制备

单细胞悬液：待测样本（如血液、培养细胞、组织消化液等）需制备为单个分散的细胞悬液，避免细胞团块干扰检测。

荧光标记：用荧光染料偶联的抗体或荧光探针标记目标分子（如细胞表面蛋白、胞内因子、DNA含量等）。不同荧光染料对应不同检测通道（如FITC、PE、APC等）。

二、液流系统与细胞排列

鞘液与层流：样本液被鞘液（无细胞缓冲液）包裹，通过流体动力学聚焦技术形成单细胞流。鞘液的高流速迫使细胞在流动室中排列成单列，逐个通过检测点（类似“细胞排队”）。

三、激光激发与光信号产生

激光照射：单列细胞流经一束或多束激光（常见波长：488nm蓝激光、633nm红激光等），细胞与激光相互作用产生两种信号：

散射光：

前向散射光（FSC）：反映细胞大小或体积。

侧向散射光（SSC）：反映细胞内部复杂度（如颗粒度、核形）。

荧光信号：细胞上的荧光标记被激发后发射特定波长的荧光，反映目标分子的表达水平（如CD3、CD4等抗原）。

四、信号检测与分选

光学系统：

光电检测器：散射光由光电二极管（FSC）和光电倍增管（SSC/荧光）接收。

滤光片系统：通过分光镜和带通滤光片分离不同波长的荧光信号（如FITC：530/30nm，PE：575/26nm）。

数据转换：光信号转换为电信号，经数字化处理后生成数值（如荧光强度、散射光强度）。

细胞分选（可选）：在流式分选仪（FACS）中，通过液滴充电和偏转电场分离目标细胞。

五、数据分析

多参数分析：通过软件（如FlowJo、BD FACSDiva）对数据进行可视化（散点图、直方图、等高线图等），结合设门（Gating）策略区分细胞亚群。

例如：通过FSC/SSC区分活细胞与碎片，通过CD4+/CD8+荧光标记分析T细胞亚群。

六、核心应用领域

免疫表型分析：如淋巴细胞亚群（CD4+、CD8+ T细胞）检测。

细胞功能研究：胞内细胞因子、钙离子浓度、细胞凋亡（Annexin V/PI）检测。

DNA含量与细胞周期分析：碘化丙啶（PI）标记DNA分析G0/G1、S、G2/M期。

稀有细胞分选：如干细胞、循环肿瘤细胞（CTC）分选。

七、技术特点

高通量：每秒可检测数千至上万个细胞。

多参数：同时检测多个荧光标记（现代仪器可达20+参数）。

定量与定性结合：提供荧光强度、细胞比例、绝对计数等数据。

高灵敏度：可检测低表达分子或稀有细胞（＜0.01%）。

流式细胞术通过整合流体力学、光学、电子学和生物标记技术，实现了对细胞群体的精准解析，是现代免疫学、肿瘤学、血液学研究的重要工具。

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