单细胞组织解离的实验方法与实验步骤及注意事项！
小杨 / 2025-04-12 09:08:40
百欧博伟生物：以下是单细胞组织解离的详细实验方法，适用于后续单细胞测序、流式细胞术或单细胞功能分析。实验步骤需根据具体组织类型（如肝脏、脑、肿瘤等）调整酶解条件。
一、实验前准备
1、试剂与耗材
组织保存液（如HBSS或PBS，含1% BSA或FBS，预冷至4℃）
组织解离酶（根据组织类型选择，常用酶包括胶原酶IV、透明质酸酶、DNase I、胰蛋白酶等）
红细胞裂解液（如ACK lysing buffer，针对含血组织）
细胞筛（70 μm、40 μm尼龙滤网）
离心管、冰盒、镊子、手术剪、培养皿（预冷）
台盼蓝或AO/PI染料（细胞活性检测）
2、仪器
恒温水浴摇床（37℃）
离心机（4℃预冷）
显微镜（评估细胞状态）
生物安全柜（无菌操作）
3、安全措施
无菌操作（全程在生物安全柜内进行）
戴手套、口罩，避免样本污染
二、实验步骤
1、组织获取与预处理
取材：快速获取新鲜组织（<30分钟），置于预冷的组织保存液中（4℃运输）。
清洗：用预冷PBS冲洗3次，去除血液和杂质。
剪切：用无菌手术剪将组织剪成1-3 mm³小块（越小越好，增加酶解效率）。
2、酶解消化
酶解液配制（以肿瘤组织为例，需根据组织硬度调整）：
HBSS + 胶原酶IV（1-2 mg/ml）
+ 透明质酸酶（0.1-0.5 mg/ml）
+ DNase I（10-50 U/ml）
+ 2% FBS（抑制过度消化）
孵育：
将组织块转移至酶解液中（1 g组织/5-10 ml酶解液）。
37℃摇床孵育（转速50-100 rpm，时间15-60分钟，根据组织类型调整）。
每隔10分钟轻吹打或用移液枪反复吹吸，加速解离。
3、终止消化与过滤
终止：加入含10% FBS的冷培养基终止反应。
过滤：依次通过70 μm和40 μm细胞筛，去除未解离的团块。
离心：4℃ 300-500 ×g 离心5分钟，弃上清。
4、红细胞裂解（可选）
若组织含较多红细胞（如脾脏、肿瘤）：
加入1-2 ml红细胞裂解液（如ACK lysing buffer），冰上裂解2-5分钟。
立即加入10倍体积PBS终止，离心后重悬。
5、细胞洗涤与评估
洗涤：用预冷PBS或含BSA的缓冲液洗涤2次。
细胞计数：用台盼蓝染色，显微镜或自动细胞计数仪评估活率（需>80%）。
分选前处理（如需要）：
使用Dead Cell Removal Kit去除死细胞。
标记抗体（如抗CD45去除免疫细胞）。
三、关键注意事项
1、保持细胞活性：
全程低温操作（除酶解步骤外）。
避免过度消化（可预实验确定最佳时间）。
2、避免细胞结团：
加入DNase I降解释放的DNA。
轻柔吹吸，避免机械损伤。
3、组织特异性调整：
脑组织：需添加神经保护剂（如BSA、抗氧化剂），缩短消化时间。
肝脏/胰腺：胶原酶浓度需提高至3-5 mg/ml。
实体瘤：可能需多步酶解（如先胶原酶后胰酶）。
四、常见问题与解决
细胞活性低：减少消化时间或降低酶浓度；预冷所有试剂。
细胞结块：增加DNase I浓度或过滤次数。
产量低：延长消化时间或机械辅助（如gentleMACS解离仪）。
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