RIN-m5F细胞系的知识与应用及培养操作！
小杨 / 2024-03-12 09:13:03
一、背景
RIN-m5F是一种来源于大鼠的胰岛β细胞瘤细胞系。这些细胞是通过大剂量放射线照射近交系NEDH大鼠，再经过裸鼠维持肿瘤后得到的。RIN-m5F细胞系具有分泌胰岛素及L型多巴脱羧酶的特性，但不产生生长激素抑制激素。因此，它们常被用于胰岛细胞信号转导和胰岛肿瘤相关的研究。
在研究中，RIN-m5F细胞系常被用作体外模型来模拟胰岛β细胞的功能和行为。例如，它们可以用于研究胰岛素的分泌、合成和代谢等生物学过程，以及胰岛β细胞在糖尿病等疾病中的变化。此外，RIN-m5F细胞系也可以用于药物筛选和毒理学研究，以评估药物对胰岛β细胞的影响和潜在毒性。
然而，需要注意的是，虽然RIN-m5F细胞系具有一定的代表性，但并不能完全模拟真实的人体环境。因此，在将实验结果应用于临床之前，仍需要进行更多的实验验证和临床研究。
此外，有研究表明，金丝桃素的光动力学效应可以显著地抑制RIN-m5F细胞的增殖，这为开发新的抗肿瘤药物提供了思路。同时，RIN-m5F细胞系也被用于软琼脂克隆形成实验，以研究化合物对细胞活力的影响。
1)复苏RIN-m5F细胞系：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)RIN-m5F细胞系传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)RIN-m5F细胞系冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。
下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
三、应用
RIN-m5F可以用于γ-氨基丁酸对RIN-m5f细胞的保护作用及机制探究：
研究拟建立高糖（G）和H2O2氧化损伤RIN-m5f细胞模型，以探讨GABA对胰岛β细胞抗氧化调节作用及其作用机制。
方法：分别采用11mM、22mM、44mM G孵育RIN-m5f细胞48h，以及10μM、50μM、100μM H2O2孵育1h建立体外氧化损伤细胞模型。GABA干预实验分为：对照组（11mM G）、损伤组（G/H2O2）、GABA组（G/H2O2+GABA）、硫辛酸组（G/H2O2+LA）。采用DCFH-DA荧光探针法检测细胞内ROS水平；检测细胞氧化还原状态指标和胰岛素分泌水平；MTT法测定细胞存活率；流式细胞术检测细胞凋亡线粒体膜电位；RT-PCR法检测与抗氧化、抗凋亡和胰岛素分泌相关基因mRNA表达水平；Western blot法检测Nrf2和GSK-3β蛋白水平、p-GSK-3β（Ser9）和p-GSK-3β（Tyr216）磷酸化水平。
结果：随着G和H2O2浓度的增加，胞内ROS和MDA水平显著提高（P<0.05），且GAD1mRNA表达水平极显著下调（P<0.01），细胞均出现不同程度的氧化损伤（P<0.05）；添加100μM和200μM GABA可显著降低胞内ROS和MDA水平（P<0.05），提高T-AOC、GSH-Px、CAT、SOD活力，上调抗氧化及抗凋亡相关基因Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2mRNA表达水平（P<0.05），提高细胞线粒体膜电位和存活率（P<0.05）；此外，GABA可显著提高胰岛素合成相关基因（INS-2、Pdx-1、MafA、GK、GLUT2、Gabra2）mRNA表达水平（P<0.05），促进胰岛素分泌释放；Western blot结果显示，GABA显著抑制氧化损伤细胞（44mM G和100μM H2O2）GSK-3β蛋白水平（P<0.05），显著提高p-GSK-3β（Ser9）磷酸化水平和Nrf2核质比例（P<0.05），但对p-GSK-3β（Tyr216）磷酸化水平无显著性影响（P>0.05）。
结论：GABA可显著增强氧化损伤（G和H2O2）RIN-m5f细胞抗氧化能力，提高细胞存活率和胰岛素合成分泌，具有抗凋亡作用；GABA可调节胞内GSK-3β/Nrf2通路相关基因mRNA表达水平，显著提高Nrf2核质比例，增强细胞抗氧化能力，其作用机制可能与提高p-GSK-3β(Ser9)磷酸化水平、降低GSK-3β蛋白水平有关；GABA抗氧化调节作用具有浓度依赖效应，即随着氧化损伤程度的增加，GABA需要量增加。
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