NCI-H719细胞系人小细胞肺癌细胞的知识与应用！
小杨 / 2024-02-06 09:16:07
一、背景
NCI-H719细胞系|人小细胞肺癌细胞是一种人小细胞肺癌细胞系，建立于1973年。NCI-H719细胞系|人小细胞肺癌细胞生长特性为半贴壁，细胞传代方法为1:2-1:3传代，每周换液2-3次。需要注意的是，该细胞系需要在低温避光的环境下保存。
1)复苏NCI-H719细胞系|人小细胞肺癌细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6 cm皿中，加入约4 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)NCI-H719细胞系|人小细胞肺癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.02%EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1-3min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)人小细胞肺癌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。
下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
三、应用
目的：
(1)利用靶向高通量测序技术筛选适合靶向治疗方案的晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)获益人群,同时探索通过靶向高通量测序技术获得的肿瘤突变负荷(Tumor mutational burden,TMB)是否可以作为免疫治疗预测标记物,分析靶向高通量测序技术作为临床动态监测和指导NSCLC患者靶向治疗和免疫治疗的可行性,从而为NSCLC患者快速精确及个体化治疗提供依据;
(2)分析非小细胞肺癌患者中的PIK3CA突变类型与临床病理特征的相关性,同时分析PIK3CA与EGFR突变共存NSCLC患者接受表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)治疗预后情况,进一步揭示PIK3CA突变在晚期EGFR突变NSCLC患者预后的预测价值以及与EGFR突变耐药的相关性,为晚期NSCLC患者的有效治疗提供新的靶点,同时为对EGFR-TKIs产生耐药的晚期NSCLC患者的耐药逆转提供新的思路;
(3)探讨PI3K/Akt通路抑制剂LY294002对EGFR-TKI原发性耐药的非小细胞肺癌细胞对厄洛替尼的敏感性的影响并分析其内在分子机制,为EGFR-TKIs联合PI3K抑制剂对逆转NSCLC的耐药性的临床治疗提供理论依据。
方法：
(1)回顾性分析533例初诊和复发的非小细胞肺癌患者的临床病理资料,提取患者血液或肿瘤组织中的DNA并进行靶向高通量测序,靶向测序基因包括EGFR、TP53、ALK、ROS1、BRAF、KRAS、ERBB2、PIK3CA在内的34个常见肿瘤用药相关基因,使用卡方检验分析EGFR、BRAF、ALK、ROS1突变与临床病理特征相关性;利用生物信息学方法计算患者TMB值,免疫组织化学方法检测非小细胞肺癌患者肿瘤组织表面PD-L1表达水平,通过R软件3.5.3版本分析TMB与PD-L1表达水平的相关性;以TMB平均值为临界值将接受免疫治疗的非小细胞肺癌患者分为TMB高(TMB-H)和TMB低(TMB-L)两组,并采用Kaplan-Meier生存分析两组患者与无进展生存期(progression-free survival,PFS)关系,绘制生存曲线;
(2)回顾性分析29例PIK3CA突变非小细胞肺癌患者临床病理特征,利用卡方检验分析不同PIK3CA突变类型与临床病理特征相关性。靶向高通量测序技术分析与PIK3CA突变共存的其他驱动基因突变类型,根据PIK3CA是否与EGFR共突变,将接受EGFR-TKI治疗的晚期非小细胞肺癌患者分为PIK3CA与EGFR共突变组和只有EGFR突变组,并采用Kaplan-Meier生存分析两组患者与无进展生存期(progression-free survival,PFS)关系,绘制生存曲线,分析PIK3CA突变是否影响EGFR突变非小细胞肺癌患者接受EGFR-TKI治疗效果;
(3)通过MTT实验分析不同浓度LY294002和厄洛替尼对NCI-H460、NCI-H719细胞系|人小细胞肺癌细胞和NCI-H661的细胞生长增殖的影响,同时分析联合EGFR-TKI厄洛替尼和PI3K抑制剂LY294002对NSCLC细胞生长的抑制作用;利用流式细胞仪分析厄洛替尼或LY294002以及厄洛替尼与LY294002联合用药对NSCLC细胞NCI-H460、NCI-H719细胞系|人小细胞肺癌细胞和NCI-H661细胞凋亡的影响;提取厄洛替尼或LY294002以及厄洛替尼与LY294002联合用药处理后的NCI-H460和NCI-H661细胞的总蛋白,利用蛋白免疫印迹(Western Blot)技术检测PI3K/AKT信号通路相关蛋白p70S6K和磷酸化p70S6K蛋白的表达水平。
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