NCI-H1770人非小细胞肺癌贴壁细胞系的应用！
小杨 / 2024-01-29 10:48:59
一、背景
NCI-H1770人非小细胞肺癌贴壁细胞系的上皮样细胞呈多角形，尺寸更为规则，贴附在基质上呈散在斑片状生长。这种细胞系的培养实验室的具体要求主要取决于开展的研究类型。例如，专业从事癌症研究的哺乳动物细胞培养实验室与从事蛋白质表达工作的昆虫细胞培养实验室等。
1)复苏NCI-H1770人非小细胞肺癌贴壁细胞系细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)NCI-H1770人非小细胞肺癌贴壁细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)NCI-H1770人非小细胞肺癌贴壁细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。
下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
三、应用
阐明L1CAM(L1 cell adhesion molecule)对肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响,并揭示调控L1CAM功能的分子机制。
研究方案：
1、L1CAM与肺腺癌的临床相关性研究收集经手术完整切除的,并有配对癌旁正常组织的88例肺腺癌标本,使用免疫组织化学技术检测L1CAM的表达水平,并分析其表达量与患者预后的临床相关性。
2、LICAM对肺腺癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响
(1)在肺腺癌细胞A549、NCI-H1299及NCI-H1770中,过表达或沉默L1CAM,通过Transwell、细胞增殖和细胞划痕等实验检测L1CAM对肺腺癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响;
(2)采用转座子系统构建sh L1CAM的小鼠原位肺癌模型,注射6周后处死小鼠,取肺组织标本计数肿瘤形成数量;
(3)在H460SM细胞过表达或沉默L1CAM,通过经支气管肺内原位接种构建裸鼠气管内原位肿瘤模型,达到预期终点后处死裸鼠,并比较实验组与对照组肿瘤大小及转移情况。
3、鉴定肺腺癌中上调L1CAM表达的通路及其对生物学功能的影响
(1)在NCI-H1770人非小细胞肺癌贴壁细胞系中通过si RNA干扰技术及Western blot检测沉默PAK4、Slug后,L1CAM表达情况;
(2)在先前收集的肺癌患者手术标本中通过Western blot验证PAK4、Slug的蛋白表达水平;
(3)通过生物信息学分析探索在抑制PAK4的mi RNA;
(4)通过RNAi技术在SPC-A-1,SPC-A-1sci转染mi RNA或其抑制剂,采用q PCR,Western blot实验检测PAK4、Slug、L1CAM表达情况以及EMT相关蛋白(E-cadherin和Vimentin)的表达水平。
(5)采用Transwell及划痕试验验证转染后的SPC-A-1及SPC-A-1sci细胞侵袭和迁移能力。
(6)在裸鼠中尾静脉注射转染后的SPC-A-1sci或SPC-A-1细胞,7周后测量肺部转移瘤数量,进一步验证mi RNA通过PAK4/Slug/L1CAM途径在肺腺癌中发挥的生物学功能。
研究结果：
1、在收集的肺腺癌组织标本中,癌组织L1CAM表达水平高于与其配对的癌旁组织;患者生存分析表明L1CAM高表达组较之于低表达者预后差(P<0.05)。
2、在A549,NCI-H1299,NCI-H1770人非小细胞肺癌贴壁细胞系中过表达L1CAM后,肺腺癌细胞侵袭和迁移能力较对照组明显增强;沉默L1CAM,上述三组肺腺癌细胞的侵袭和迁移能力显著降低,并可抑制小鼠肿瘤模型中原发性肺癌及转移瘤的数量。然而细胞增殖实验结果表明敲低或者过表达L1CAM后细胞增殖能力较对照组没有显著差异。
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