S91小鼠黑色素瘤细胞的特点与应用及培养操作！
小杨 / 2024-01-25 09:43:06
一、背景
S91小鼠黑色素瘤细胞系是一种常用的实验动物模型，用于研究黑色素瘤的发生、发展和治疗。该细胞系来源于C57BL/6小鼠，具有高度的恶性程度和侵袭性，能够快速生长并形成肿瘤。
高度恶性：S91小鼠黑色素瘤细胞系具有高度的恶性程度，能够在体外快速生长并形成肿瘤。
侵袭性：S91小鼠黑色素瘤细胞系具有较强的侵袭性，能够穿过基底膜并进入周围组织。
易转移：S91小鼠黑色素瘤细胞系容易发生转移，可以通过血液或淋巴系统扩散到其他部位。
可重复性好：S91小鼠黑色素瘤细胞系的生长和转移过程可以重复多次，且结果稳定可靠。
S91小鼠黑色素瘤细胞系广泛应用于肿瘤学研究中，包括肿瘤发生机制的研究、抗肿瘤药物的筛选和评价、肿瘤免疫治疗的研究等。
1)复苏S91小鼠黑色素瘤细胞系：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)S91小鼠黑色素瘤细胞系传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)S91小鼠黑色素瘤细胞系冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
四、应用
探究真菌Xylaria sp.DO1801次级代谢产物CQ的抗黑色素瘤作用,并解析其对细胞骨架微丝聚合的影响及分子机制。首先,本研究通过构建体内B16同种异体小鼠皮下瘤模型,结合体外实验检测CQ对黑色素瘤细胞增殖、凋亡、迁移及微丝解聚作用的影响,研究CQ抗黑色素瘤的药理作用。
研究发现,CQ通过诱导微丝解聚导致S91小鼠黑色素瘤细胞系增殖抑制、凋亡增加、迁移受限,从而发挥良好的抗黑色素瘤效应。随后,通过LC-MC非靶向代谢组学技术系统地分析CQ对黑色素瘤细胞内小分子代谢物的影响,进一步探究CQ对黑色素瘤细胞代谢过程的影响并解析其作用分子机制。S91小鼠黑色素瘤细胞系研究发现,CQ主要影响黑色素瘤细胞内肌酸代谢通路,而磷酸肌酸预处理可拮抗CQ的作用,恢复胞内ATP水平、抑制微丝解聚、减少增殖抑制并抵抗凋亡诱导。此外,检测黑色素瘤细胞内葡萄糖代谢发现CQ抑制S91小鼠黑色素瘤细胞系内葡萄糖摄取、糖酵解和氧化磷酸化,表明CQ可抑制黑色素瘤细胞内肌酸代谢和葡萄糖代谢,从而抑制相关的ATP再生并诱使细胞骨架微丝解聚。
最后,基于肌酸激酶B(CKB)在肿瘤细胞肌酸代谢中的核心作用,通过细胞热转变分析实验(CETSA)、微量热泳动(MST)实验、体外酶活抑制实验和分子对接的方法研究CQ对CKB的作用方式,明确CQ的作用靶点和相关分子机制。S91小鼠黑色素瘤细胞系研究发现,CQ以底物竞争的方式抑制CKB酶活性。CKB低表达的S91小鼠黑色素瘤细胞系内ATP浓度降低、微丝聚合抑制、细胞增殖减少、凋亡增加,但对CQ敏感性降低。检测肿瘤相关代谢通路和肌酸代谢关键酶胍基乙酸-N-甲基转移酶(GAMT)和CKB发现,CQ处理或CKB沉默后,S91小鼠黑色素瘤细胞系内PI3K/AKT/FoxO1信号通路下调,然而肌酸和磷酸肌酸可逆转CQ对PI3K/AKT/FoxO1信号通路的下调;同时,CQ处理或CKB沉默抑制GAMT和CKB表达,而肌酸、磷酸肌酸、激活PI3K通路可恢复GAMT和CKB的表达。这提示肌酸代谢与PI3K/AKT/FoxO1通路间可形成反馈环并介导CQ促微丝解聚和抗黑色素瘤作用。综上所述,本研究发现CQ通过靶向抑制CKB,干扰肌酸代谢,并以反馈环的形式下调PI3K/AKT/FoxO1通路,从而促进微丝解聚并介导其级联的抗黑色素瘤作用。
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