沙雷菌通用PCR试剂盒的组成与应用及相关研究！
小杨 / 2024-01-23 09:17:36
一、背景
沙雷菌通用PCR试剂盒是一种用于检测沙雷菌的PCR试剂盒。沙雷菌是一种常见的细菌，存在于各种环境中，包括水、土壤、食品等。该试剂盒通过特定的PCR引物和探针，能够特异性地检测沙雷菌的DNA，从而实现对沙雷菌的快速、准确检测。
沙雷菌是一种革兰氏阴性菌，可以引起多种感染，包括尿路感染、呼吸道感染和血液感染等。该试剂盒包含PCR反应体系和引物，可以扩增沙雷菌的DNA序列，从而实现对沙雷菌的快速检测和鉴定。
PCR反应缓冲液：用于调节PCR反应体系的pH值和离子强度。
dNTPs:即脱氧核苷酸三磷酸，是PCR反应中必需的原料。
MgCl2:即二氢氧化镁，是PCR反应中必需的离子。
TaqDNA聚合酶：即热稳定DNA聚合酶，可以催化DNA的合成反应。
引物：即特异性DNA序列，可以与目标DNA序列互补结合，引导PCR反应进行。
1、样本采集：从患者体内采集血液、粪便、组织等样本，并将其保存在无菌容器中。
2、DNA提取：将采集到的样本进行DNA提取，通常采用柱式或磁珠式DNA提取试剂盒。提取后的DNA应保存在-20°C或更低的温度下。
3、PCR反应体系准备：根据试剂盒说明书的要求，配制PCR反应体系，包括引物、荧光探针、dNTPs、DNA聚合酶等。
4、PCR反应：将提取的DNA加入到PCR反应体系中，进行PCR反应。反应条件和时间根据试剂盒说明书的要求进行设置。
5、结果分析：将PCR反应后的产物进行荧光信号检测，根据荧光信号的出现情况判断是否存在沙雷菌的感染。
四、应用
沙雷菌通用PCR试剂盒可以用于临床分离黏质沙雷菌质粒编码的16S rRNA甲基化酶基因与β-内酰胺酶基因的研究：
安徽地区临床分离黏质沙雷菌药敏情况和质粒介导的16S r RNA甲基化酶检出率与基因型,为临床合理选择抗菌药物提供依据。研究临床沙雷菌通用PCR试剂盒分离黏质沙雷菌质粒介导的16S r RNA甲基化酶耐药基因与β-内酰胺酶基因的共转移情况。
材料与方法：菌株来源201株黏质沙雷临床分离菌株,来源于安徽省细菌耐药监测中心监测网所属34所医院(由皖南、皖中、皖北不同级别的医院组成)2005年2012年每年9月份住院和门诊患者的各类临床标本。药敏实验质控菌株大肠埃希菌ATCC25922,转移接合试验受体菌大肠埃希菌J53 AZR,二者均为安徽省细菌耐药监控中心保存。
方法：
1、采用MH琼脂倍比稀释法测定临床分离黏质沙雷菌株对抗菌药物的敏感性,质控菌采用E.coli ATCC 25922。
2、煮沸法提取细菌的总DNA,碱裂解法提取质粒DNA;用沙雷菌通用PCR试剂盒聚合酶链反应(PCR)方法扩增质粒介导16S r RNA甲基化酶基因;PCR产物纯化测序,测序结果在Gen Bank中经Blast程序比对分析,以明确16S r RNA甲基化酶基因的基因型别以及是否突变。
3、用16S r RNA甲基化酶基因阳性菌株与大肠埃希菌J53AzR行转移接合试验;对接合子进行生化鉴定并经PCR检测耐药基因,沙雷菌通用PCR试剂盒PCR扩增产物DNA测序确认;采用Muller-Hinton琼脂对比稀释法测定大肠埃希菌J53AzR与接合子对抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC)。
4、以16S r RNA甲基化酶基因阳性临床分离菌株的总DNA为模板,采用沙雷菌通用PCR试剂盒PCR方法扩增β-内酰胺酶基因;PCR产物纯化测序,测序结果在Gen Bank中经Blast程序比对,比较分析16S r RNA甲基化酶基因型别与β-内酰胺酶基因型别关系。
5、以16S r RNA甲基化酶基因阳性接合子菌株质粒DNA为模板,沙雷菌通用PCR试剂盒PCR扩增β-内酰胺酶基因;PCR产物纯化测序,测序结果在Gen Bank中经Blast程序比对,明确基因型。探究16S r RNA甲基化酶基因与β-内酰胺酶基因是否共转移。
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