一、背景
小鼠胚胎肝细胞是在用鸟氨酸和苯丙氨酸代替精氨酸和酪氨酸的平板上选择建立的细胞株；检测表明，BNL CL.2细胞肢骨发育畸形病毒(鼠痘)阴性。
二、小鼠胚胎肝细胞（BNL CL.2）培养步骤
1、小鼠胚胎肝细胞（BNL CL.2）培养基及培养冻存条件准备：
1）DMEM+10%FBS+1%P/S
2）培养条件：Atmosphere:Air,95%;CO2,5%，Temperature:37℃。
3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。
4）Medium Renewal：every 2 to 3 days
2、细胞处理：
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。
三、应用
小鼠胚胎肝细胞可以用于Brg1通过miR-187-5p/Hippo信号通路调节小鼠肝再生的机制研究：
1、观察小鼠肝脏特异性Brahma相关基因1(Brahma-related gene1,Brg1)缺失对肝再生(Liver Regeneration,LR)的影响。
2、研究mi R-187-5p在Brg1调控LR过程中的作用。3.探讨Brg1及mi R-187-5p与Hippo信号通路的联系,并初步阐明Brg1调控LR过程中的机制。
方法：
1、将Brg1 lox P/lox P小鼠与albumin-Cre小鼠交配,选择性地敲除肝细胞中的Brg1。用蛋白质印迹法(Western Blot,WB)检测肝脏特异性Brg1缺失(Brg1-/-)小鼠(KO组)肝组织样本中Brg1蛋白的表达,以验证Brg1基因敲除率;检测KO组小鼠肝体重比及肝功(ALT、AST)与正常C57BL/6小鼠(WT组)相比有无差别,并用HE染色及Ki-67免疫组化分别检测KO小鼠肝脏与WT小鼠相比有无病理学及肝细胞增殖情况改变。对8周龄雄性KO组小鼠及其同周龄、性别的WT组小鼠进行了2/3部分肝切除术(Partial hepatectomy,Ph)。在术后0h、24h、36h、48h、72h和168h(7d)采集小鼠肝脏组织样本并观察小鼠肝脏再生情况,并用免疫组化检测两组样本中反应肝细胞增殖指标(Ki-67及Brd U阳性细胞率)的情况。
2、利用Target Scan和mi RWalk两个在线数据库对Brg1及Hippo信号通路中关键调控激酶LATS1的潜在靶mi RNA进行相关性预测分析,并用定量实时聚合酶链反应(RT-q PCR)对样本中目标mi RNA的表达进行验证。根据验证结果进行回复实验:对Brg1缺失小鼠(Brg1-/-)小鼠(KO组)注射相应外源性mi RNA功能模拟物(agomir),并将其与同周龄、同性别的C57BL/6小鼠(WT组)上进行了2/3Ph。在术后0h、24h、36h、48h、72h和168h(7d)采集小鼠肝脏组织样本,观察小鼠肝脏再生情况,用免疫组化检测两组样本中反应肝细胞增殖指标(Ki-67和Brd U阳性细胞率)的情况。
3、用WB法检查KO组和WT组小鼠肝脏组织样本中周期蛋白(Cyclin D1、Cyclin A和Cyclin E1)、周期蛋白激酶CDKs、Hippo信号通路中关键调控激酶LATS1及下游蛋白YAP表达情况,探讨Brg1及mi R-187-5p与Hippo信号通路的联系,并初步阐明Brg1调控LR过程中的机制,以及mi R-187-5p模似物回输后对上述细胞周期蛋白、周期蛋白激酶和LATS1及YAP的影响。
4、本实验所有数据采用SPSS 22.0统计分析软件进行统计分析,结果用均数±标准差(M±SD)表示,以P<0.05或P<0.01表示差异有统计学意义。
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